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细胞因子对骨髓间充质干细胞增殖及其向心肌细胞分化的影响

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发表于 2009-3-3 12:18 |显示全部帖子
作者:鲍翠玉  马业新  郭军  郑敏 赵骥作者单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,湖北  武汉  430030 ( ^# P) q. k) q6 ]
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          【摘要】  目的  探讨干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(GCSF)预处理对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的作用。方法  将SD大鼠随机分成对照组、SCF组、GCSF组和SCF+GCSF联合处理组。流式细胞仪检测第4代MSCs细胞周期。用DAPI(25 mg/ml)标记的P4MSCs与心肌细胞共培养。在共培养的第1天至第5天用免疫荧光技术分别检测心肌特异性肌节肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白T(TnT)的表达,统计向心肌样细胞分化的MSCs百分率。结果  (1)SCF和GCSF联合应用能明显诱导MSCs进入S期,单因子SCF组和GCSF组与对照组相比,也明显的促进MSCs由G0/G1期进入S期(P<001)。(2)MSCs与心肌细胞共培养后,SCF和GCSF联合组MSCs表达心肌特异性蛋白MHC及TnT的阳性百分率均显著增高,单细胞因子组MSCs的心肌特异性蛋白MHC及TnT的阳性表达亦较对照组高。结论  SCF和GCSF对MSCs具有促增殖、促分化的作用。 0 c+ g6 T% H7 e: x3 ]
          【关键词】骨髓间充质干细胞 干细胞因子 粒细胞集落刺激因子 心肌细胞 分化
" `; D, z4 n' N" v! q* j$ J                    The effect of cytokines on proliferation and differentiation of bone mesenchymal stem cells into cardiomyogenic cells
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  BAO CuiYu, MA YeXin, GUO Jun, et al
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  Department of Cardiology, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei, China+ r' d( m1 W( g$ c8 V: u# d% k
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  【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of pretreatment of stem cells factor (SCF) and granulocyte colonystimulating factor (GCSF) on proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into cardiomyogenic cellsMethodsThe SD rats were randomly divided into control, SCF, GCSF and SCF GCSF group The 4th passage MSCs' cellular cycle was valued by flowcytometry The 4th passage of MSCs labeled by DAPI was cocultured with cardiomyogenic cells The proteins expression of cardiac myosin heavy chain (MHC) and troponin T (TnT) were detected with immunofluorescence technique from the first day to the fifth day to calculate the percentage of the differentiation of MSCs into cardiomyogenic cellsResults①The percentage of MSCs in G0/G1 phase of the SCF/GCSF group was significantly lower than that of SCF GCSF and control group (P<001) The percentage of MHC proteins?positive MSCs of SCF/GCSF group was significantly higher than that of SCF group, GCSF group, and the control group, and that of SCF group and GCSF group was significantly higher than that of the control group ②The positive percentage of MHC and TnT in SCF GCSF group was significantly higher than that of SCF/GCSF and control group, and that of SCF and GCSF group was significantly higher than that of control groupConclusionsSCF and GCSF could play the promotion role in proliferation and differentiation of MSCs/ z$ S+ Y; M5 t1 R3 A, d
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  【Key words】Mesenchymal stem cells (MSCs); Stem cells factor (SCF); Granulocyte colonystimulating factor (GCSF); Cardiomyocytes; Differentiation, z$ _8 h$ `2 G7 c4 g+ Y

7 w6 x; p! B2 p  Q  近年来用干细胞移植的方法修复受损的心脏成为研究的热点。在众多的供体细胞中,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)倍受关注,但MSCs的定向分化率还较低,如何提高MSCs的分化能力,保证其稳定的分化方向是目前急需解决的问题。有研究表明干细胞因子(Stem Cells Factor,SCF) 和粒细胞集落刺激因子(Granulocyte ColonyStimulating Factor,GCSF)作为一种传统的作用于早期造血细胞的细胞因子,能加速MSCs的增殖〔1〕。并发现MSCs在增殖分化的过程中持续表达SDF1、SCF、MCSF、GCSF等细胞因子〔2,3〕,由此可以推测这些细胞因子对MSCs的增殖分化具有一定的作用。本文探讨GCSF和SCF对MSCs的促增殖分化能力,为临床开展细胞移植治疗心肌梗死提供基础。% r, n! i" V# e2 A7 j! b
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  1材料与方法! n) R8 A( t1 P7 ^9 [6 X

2 [) e5 o; p- ?9 G  11动物SD大鼠,雌雄不拘,体重(150±20)g,出生1~2 d SD新生大鼠,均由本院实验动物中心提供。# t& \8 |5 P2 K2 r$ V6 `) `

7 H( v1 A4 j: V2 W  12试剂与仪器DMEM(Sigma),胎牛血清(Hyclone),rhGCSF(Peprotech),rmSCF(Peprotech),荧光染料DAPI(4,6diamidino2phenylindole,DAPI)(Gibco),胶原酶(Sigma),胰蛋白酶(Sigma),小鼠抗大鼠Troponin T单克隆抗体(Neomarkers),小鼠抗大鼠心肌特异性肌节肌球蛋白重链(cardiac myosin heavy chain a/b,MHCa/b)单克隆抗体(Neomarkers),TRITC标记的羊抗小鼠IgG(Gibco),荧光显微镜(Olympus),倒置相差显微镜(Olympus)。( D  l* m6 W- o( U

: }6 V4 a* R+ d  13方法" F$ {3 X. N% U! Q
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  131动员剂的使用SCF组大鼠(n=12)用rmSCF(20 μg-1·kg-1·d-1),GCSF组大鼠(n=12)用rmGCSF(10 μg·kg-1·d-1),SCF+GCSF联合组(n=12)用rmSCF(20 μg·kg-1·d-1)、rmGCSF(10 μg·kg-1·d-1),对照组(n=12)用相等量的生理盐水,均为每天一次皮下注射,连续5 d。第7天处死大鼠,取骨髓液。. O: u( Z; I9 f5 N5 \% N

3 k+ k7 V+ N+ K- k! O3 M  132MSCs的提取、培养及纯化成年大鼠乙醚麻醉后浸泡于75%乙醇中,5 min后取股、胫骨,剪开两端,1500 r/min,5 min离心冲出骨髓,弃上清,加入培养基(HDMEM、10鸖、2 mm/L谷氨酰胺、青霉素G100 U/ml、链霉素100 mg/ml、两性霉素B85 μg/ml),吹打成悬液,按1105/ml MSCs接种于35mm塑料培养皿,37℃、5%CO2培养。24 h后换液,以后每3 d换一次液,待细胞接近70%融合时用025%胰蛋白酶 004鞹A消化,制成单细胞悬液,按1:3传代,通过不断的换液与传代逐渐纯化扩增MSCs,共传4~5代。" m2 S/ V+ ^3 `4 n
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  133心肌细胞的分离培养,建立体外心肌微环境于无菌操作下,将乳鼠的心室肌剪成1 mm3大小的碎块,用DMEM洗一次。弃去带血的上清液,组织碎块中加入含0125%胰蛋白酶,01% 胶原酶消化,每次37℃4 min,首次消化液弃去,细胞悬液转移到含有20 ml DMEM培养液的无菌试管中,并以1000 r/min离心5 min,弃上清液,细胞沉淀再次用培养液重悬。细胞悬液置于平皿中37℃静置。1 h后,小心吸出细胞悬液,接种到另一培养皿中,密度为1104个/㎝2,3 d后用于实验。! i1 }; c+ M% g8 l. F: T% q

8 \3 T2 u) ]( d1 E7 l. ~  134流式细胞仪(FACS)分析MSCs的细胞周期取第4代处于对数生长期的MSCs,每组6个皿,用025%胰蛋白酶消化;细胞悬液置于EP管中离心(1200 r/min);重悬后用70%酒精固定,RNA酶处理,PI(1 mg/ml)染色30分钟;上机检测。# v# M2 c: ]% `/ D
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  135核荧光染料标记MSCs用DAPI(25 mg/ml)标记拟做共培养的第4代MSCs,2 h后将DAPI标记的MSCs皿用D-hanks液洗10遍,在荧光显微镜下用紫外光激发(激发波长340380 nm),观察标记效果。
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  136心肌细胞与MSCs共培养消化DAPI标记的MSCs(DAPIMSCs)与未标记的培养第3天的心肌细胞,吹打成细胞悬液,计数板计数,将DAPIMSCs与心肌细胞按细胞数量比1:2混匀,按5104个/cm2接种于覆盖有盖玻片的24孔板。
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  137免疫细胞化学技术分析Troponin T (肌钙蛋白T)、MHC(心肌特异性肌节肌球蛋白重链)的鉴定:在共培养的第1天至第5天每天各取两个孔的盖玻片做免疫荧光,取出盖玻片,PBS(001 mol/L,pH72)洗三遍,冷甲醇固定30 min,1% TritonX100破膜,PBS振洗3次,1%牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min,然后加入相应的一抗(小鼠抗大鼠MHCa/b 1∶100,Tn T 1:50单克隆抗体),均需在4℃孵育过夜,二抗用TRITC连接山羊抗小鼠IgG,缓冲甘油封片,荧光镜下观察。每组每一时间点随机取12个非重叠视野(100),计数胞浆发出红色荧光的蓝色胞核(即表达TnT、MHC的DAPIMSCs)的数量及所有发蓝色荧光的细胞核(即DAPIMSCs)的数量,两者相比取平均值即为DAPIMSCs向心肌样细胞分化的百分率。
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% \8 }0 H/ U( G# A8 `6 J3 L  14统计学处理数据以x±s表示,采用t检验,用SPSS软件进行处理。, A7 E. c3 n" K6 Q

2 H/ J3 {" V  A" [1 Q# M% g$ k# V  2结果
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* w1 A) @, C& h  21MSCs生长情况取大鼠骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿,细胞呈圆形散在分布于皿底,24 h换液后换掉大部分非贴壁细胞,可见稀少的呈长梭形的贴壁细胞。3 d后梭形贴壁细胞开始增多,集落周围的贴壁细胞逐渐开始融合,进入对数增长期,8~12 d达到80%的融合,10~12 d后基本进入细胞生长的平顶期。传代细胞增殖更加迅速,8~10 d即可长满整个皿底。随着换液与传代的次数增加,MSCs逐渐得到纯化,表现为圆形和不规则形细胞细胞明显减少,3~4代后基本除尽,镜下可见以梭形为主,大小均一的贴壁MSCs(图1)。经细胞因子预处理过的骨髓干细胞增殖能力强于对照组,具体表现为无论是原代或是传代细胞的贴壁时间均缩短,细胞集落形成早且集落较多,形成细胞单层的时间缩短,每 6~7 d即可传代一次。
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  图1第3代 MSCs(200)(略)
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  22MSCs细胞周期检测结果各细胞因子组MSCs的G0/G1期细胞百分率较对照组显著降低(P<001),S期、G2/M期细胞百分率及增殖指数(Proliferation index,PI)较对照组显著增高(P<001);SCF/GCSF联合组MSCs的G0/G1期细胞百分率较GCSF组及SCF组显著降低(P<005),S期、G2/M期细胞百分率及PI值较GCSF组显著增高(P<005),S期细胞百分率及PI值较SCF组显著增高(P<005),但G2/M期细胞百分率与SCF组比较无显著差异(表1)。
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  表1流式细胞仪检测细胞周期结果(略)
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  与对照组比较:1)P<001;与SCF组比较:2)P<005; 与GCSF组比较:3)P<005;下表同
5 _$ _8 j' b& R3 [- {  n$ [" Z
; _: v# e" y. T+ X' m) z  23检测DAPI对MSCs的核标记率荧光显微镜下细胞形态观察,发现DAPI标记的MSCs胞核标记率为100%(图2a示紫外光激发并同时打开光圈的效果,图2b为同一视野下关闭光圈后紫外光激发效果)。
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  24拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析8 @# K+ i8 M9 k& T
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  241计数自发搏动的细胞8 h换液后即可见许多短柱样或梭形细胞,并有少量出现节律性搏动的细胞。心肌细胞体外培养第3天,镜下计数12个皿观察各8个不同视野下搏动的细胞团(含单个自发搏动的细胞),搏动细胞的百分比为63%,搏动频率平均50次/min。3 e- {  }' [% l: x

- o, N* R3 a- f2 p& F5 D& ^. W" _  242心肌细胞纯度分析用免疫细胞化学技术检测有Troponin T表达的阳性细胞百分比,结果阳性细胞百分比约在75%以上(图3)。
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, l1 u+ r3 ^! L% D+ W) o* X7 h  25共培养后MSCs向心肌细胞分化DAPI的激发光波长为358 nm,发射光波长为461 nm,荧光激发下发蓝光;TRITC的激发光波长为550 nm,发射光波长为570 nm,荧光激发下发红光,两者的激发光谱并不重合。通过在同一视野下转换激发光,查找有TnT或MHC表达的 DAPIMSCs,镜下可见少数蓝色细胞核周围的胞浆发出红色荧光。高倍镜下,部分发生向心肌细胞分化的 MSCs可见较清楚的心肌细胞的肌丝结构,有的可见较清楚的心肌细胞特征性横纹结构;这些心肌细胞特异性蛋白表达阳性的MSCs均与相邻心肌细胞直接接触(图4)。
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# b& z4 L! [1 O9 P% u2 O+ ]  各细胞因子组MSCs的MHC及TnT的阳性表达率均显著高于对照组(P<001),细胞因子联合组MSCs的MHC及TnT的阳性表达率均显著高于单因子组(P<005)。各细胞因子组和对照组MSCs于共培养的第1天就开始表达心肌特异性MHC蛋白,但阳性表达MHC的MSCs的百分率并没有显著差异;随着共培养时间延长,MHC阳性的MSCs也随之增加,在培养的第2、3、4、5天,各细胞因子组的DAPIMSCs表达MHC的阳性百分率显著高于对照组(表2)。各细胞因子组的DAPIMSCs于第3天开始出现TnT的表达,对照组则第4天才出现TnT的阳性表达,且第4、5天的分化率均显著低于细胞因子组(表3)。/ ]9 _# M4 [9 l/ H% M9 ]8 \0 i
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  表2不同天数DAPIMSCs表达MHC的阳性百分率(略)  \& h, E, I' f' d
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  表3不同天数DAPIMSCs表达TnT的阳性百分率(略)  B3 G5 b# H% R) V; Z) _1 o

# o/ _+ d3 F  T) }3 u  图2DAPI标记的MSCs的胞核呈蓝色荧光(200)(略)
* W! u: f) F* K: K+ ?
5 S, F; r4 e8 M8 ?- u  图3心肌细胞TnT免疫荧光染色(TRITC标记400)(略)
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  图4蓝色DAPI标记细胞核的MSCs有心肌特异性TnT阳性表达(400)(略)7 U6 L, J6 R' {6 ~! }# x: w

7 k, y4 ^( ]- K  3讨论  l0 h# _6 Y" n/ o
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3 d; G5 u2 J/ s: o# {  用细胞移植的手段增加心肌细胞的数量,修复坏死的心肌,从而改善心功能,降低病死率是近年来心血管疾病研究领域的热点。在众多的供体细胞中,MSCs倍受研究者的关注,因为与其他替代细胞如成纤维细胞、骨骼肌卫星细胞、胎心细胞、胚胎干细胞等相比,MSCs具有较多优点如可以与宿主心肌细胞之间形成良好的电机械耦连,不存在免疫排斥反应,取材方便等各种优势,因此具有大规模应用于临床的潜力。MSCs是一类存在于骨髓中的非造血干细胞,具有自我更新和多向分化的能力,可以分化中胚层和神经外胚层组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种类型的细胞。这种细胞能向心肌细胞分化的特性为自体移植治疗某些心血管疾病提供了实验论据。
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4 g1 K/ y) ^# F  目前,研究表明心肌微环境是诱导MSCs定向分化为心肌细胞 的天然诱导剂〔4~6〕。虽然其分化机制尚不确切,但可以肯定的是MSCs所处的微环境对MSCs分化所起的决定作用,如果将MSCs移植到心肌疤痕组织中去,MSCs则分化为非心肌细胞。Fukuhara等〔5〕通过体外细胞培养证实了MSCs与心肌细胞直接的电-机械刺激是MSCs心肌环境依赖性分化的必要条件,他们发现随着共培养时间的增加,MSCs表达心肌特异性蛋白的阳性率也随之增加。除了MSCs与心肌细胞之间直接的物理接触外,心肌微环境中存在的化学因素包括细胞因子、激素、离子浓度和由其他内分泌细胞和旁分泌细胞产生的可溶性物质等,构成了干细胞生长微环境的信号物质,共同调节干细胞的增殖和分化〔7〕。这些细胞因子中,转化生长因子(Transforming Growth Factorβ,TGFβ)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、干细胞因子(Stem Cells Factor,SCF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte ColonyStimulating Factor,GCSF)、骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)等诸多因子对MSCs的增殖分化起着重要作用〔8,9〕。但上述存在于微环境中的细胞因子与5氮胞苷的特性不同,5氮胞苷能够特异性诱导MSCs向心肌细胞分化,而培养环境中的化学因素如TGFβ、FGF、SCF和GCSF等细胞因子需要在心肌微环境下才能发挥其促分化作用,即细胞因子的“环境依赖性”,它们并不能单独存在使MSCs分化为心肌细胞。1 t, ?& A1 A5 N/ X- e8 P

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  GCSF与SCF的联合应用为干细胞的临床应用开创了新的前景,GCSF 和SCF作为一种传统的作用于早期造血细胞的细胞因子,也加速MSCs的增殖〔1〕。SCF为ckit原癌基因编码受体的配体蛋白,它参与机体发育中的多种细胞生长的调控,是一种多功能细胞生长因子,在细胞增殖、分化和迁移过程中发挥重要的调控作用。有研究发现MSCs在增殖分化的过程中持续表达SDF1、SCF、MCSF、GCSF等细胞因子〔2,3〕,因此可以推测这些细胞因子对MSCs的生长具有一定的作用。4 _$ U' I% O/ u0 j" P. o
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( {" K* x9 F. e! L  用细胞因子动员干细胞的方式简单、无创,优于其他的移植方式如直接注射、介入等。Orlic等〔10〕用重组大鼠SCF、重组人GCSF对心梗的小鼠预处理,结果发现实验组的梗死面积减少40﹪、心室腔扩张减少26﹪、死亡率下降68﹪、心功能明显改善。这提示GCSF、SCF对MSCs的迁移、聚集和促分化作用。现在普遍认为MSCs表达cKit,而SCF是cKit的配体,cKit/SCF通路参与了MSCs向心肌损伤的部位迁移定位和分化。Kocher等〔11〕在GCSF动员骨髓干细胞的实验中收集了一些被动员的单个核细胞,并采用耦连抗CD34单克隆抗体的磁珠分选等技术手段,经分析发现被动员的骨髓干细胞成分复杂,除造血干细胞外,还有间充质干细胞的存在,GCSF具有同时动员这两类干细胞的能力。这些试验证实了SCF和GCSF对MSCs的迁移、归巢和促分化作用,但是亦不排除造血干细胞的迁移、增殖和分化能力。; H6 l! y% u$ R' c) u$ X

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% K1 H( L1 A: t1 I  `( k# Y  A. F
! T5 ]( F: z5 S, H7 e/ ?/ J  我们用GCSF和SCF对大鼠的MSCs进行预处理,并采用将MSCs植入体外模拟的心肌微环境的方法,尽可能排除了在体实验中可能被动员的造血干细胞或其他具有分化潜能的细胞的干扰。实验结果发现SCF和GCSF对MSCs的促增殖及促分化效果是显著的。SCF和GCSF联合组MSCs处于S期和 G2/M期较单细胞因子组及对照组显著增高,单细胞因子组SCF组和GCSF组也较对照组有显著的促增殖能力。这说明SCF和GCSF均俱有促进 MSCs由静止态进入增殖态的作用。SCF和GCSF联合组MSCs表达心肌特异性蛋白如MHC及TnT的阳性百分率均显著高于单细胞因子组和对照组,单细胞因子组MSCs的分化率亦较对照组高,而且细胞因子组MSCs的TnT阳性表达较对照组提前发生。现代生物学已经证实每个细胞都有一套完整的遗传指令,但是不同的细胞却使用不同的遗传信息,因而表达不同的蛋白,这决定了细胞的不同的发育方向。细胞因子的预处理可能启动了干细胞的某些增殖及分化程序,至于细胞因子如何作用于MSCs,发挥其促增殖及促分化的作用,其具体的调控机制目前尚需深入研究。  g; ^9 E; ?% G0 g  p& R1 D& k, P/ Z
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+ G7 O* }/ k$ g- R2 \0 Q; t- K
  8  王劲,罗成基,郭朝华,等间充质干细胞与相关因子〔J〕中国实验血液学杂志,2002;10(5):46871
! C6 c5 J6 J3 M$ e2 B4 m$ p
: J9 |, X8 w( e* g
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  9  Majumdar MK,Thiede MA,Haynesworth SE,et alHuman marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long term hematopoies is when differentiated to ward stromal and osteogenic lineages 〔J〕J Hematother Stem Cell Res,2000;9:8418& z3 G8 L: S) D7 j* Y5 Z3 G+ m7 r9 V' N
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  11  Kocher AA,Schuster MD,Szbolcs ML,et alNeovascularization of ischemic myocardium by human bonemarrowderived angioblasts prevents cardio myocyte apoptosis,reduces remodeling and improves cardiac function〔J〕Nat Med,2001;7:4306

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发表于 2015-6-9 07:41 |显示全部帖子
干细胞之家是国内最好的干细胞网站了

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发表于 2015-6-17 18:33 |显示全部帖子
希瑞干细胞
免疫细胞疗法治疗肿瘤有效  

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发表于 2015-6-19 10:27 |显示全部帖子
干细胞之家微信公众号
拿分走人呵呵,楼下继续!

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发表于 2015-6-19 11:33 |显示全部帖子
设置阅读啊  

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发表于 2015-6-28 22:49 |显示全部帖子
楼上的稍等啦  

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发表于 2015-7-8 14:00 |显示全部帖子
干细胞研究重在基础

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发表于 2015-7-14 09:10 |显示全部帖子
干细胞与基因技术

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发表于 2015-7-24 08:35 |显示全部帖子
你加油吧  

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发表于 2015-8-8 09:48 |显示全部帖子
朕要休息了..............  
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