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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-19 13:23 编辑
! \+ v- B- O; ~# I; A" N2 |: k4 O9 u
to sidalin301：* W l4 {- P' k5 `1 {. j0 z) y8 s
" I6 S4 k o$ E- m8 a
你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。
2 Q6 K( `* e0 w: u* r) z
; B" c n% z; ]* Y+ W4 a 1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
" ?$ B6 @5 p! y, r; ]$ n: i0 p
' |. r6 H8 K" x9 {* m7 |2 |: ? 我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）+ J+ h, L" |4 i! n7 d8 X+ R+ F4 z
不知道你的质粒具体是其中哪一个？& m/ m! A0 g, x
0 C) i5 P G: A [2 y) h- D, E9 \
$ T8 W. f* l" X# ~, X7 X+ ^
2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。: p7 j5 L1 |4 B2 e
希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。
6 h# Y3 T$ D! S! j) h, ]! X
0 |$ b0 o$ ~9 u0 B* q1 i 3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
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/ `; {. a3 z4 q( J. p1 k, s 如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。7 B, {* p% H! a" w) Y2 B
- j! E9 @( n+ V, w; F4 Z9 @( Q# h 具体的步骤是：% p! }" o) q Z* f
$ c+ {+ ^. \4 W0 h* i$ O a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；
1 z" k$ Y& q+ @# x" D
% j. k( ]$ I) F- G2 K& f+ B: F- l d.然后分别回收你想要的片段进行连接。
& G+ V+ a6 X* ^0 K d# [8 U6 p' l ?& ]
这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
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1 B0 E1 x3 W& |' T6 H 这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。 |
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发表于 2010-10-19 13:21
