请教一个双酶切的问题

深海寂寞鱼

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4 X, E/ Y7 {2 o7 X
to sidalin301：
( k3 S& i# X2 c2 C) G5 K% {
) B1 A; x' f" o0 U) T. Z. D/ q   你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。
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6 @3 a* }: n, j5 Z  1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
- S; T6 G- ^6 A5 W% b  N    6 V* c8 {/ H3 p: o8 Y
      我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）
  |8 f& Q* o' q4 \      不知道你的质粒具体是其中哪一个？
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2010-10-19 13:11 上传

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- B& D+ Z: O  k/ w" e1 ^/ t  2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。$ W/ W7 u$ v+ P& }) s: [1 |& c5 X! Z
      希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。8 y( S6 C4 r% F  X+ G
5 r# O9 q; _+ j8 {
  3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
( X! w6 h* g- a. U9 [2 Y4 n' r
0 U  I4 r% i* `" Y) ~! R      如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。+ f- z: J5 I1 y$ d: u4 Z/ C  A
2 R' K% z5 _, L! Z4 J- q! }- b5 U
      具体的步骤是：
( u% y. w3 [# s& M
* F8 G$ l& O" H9 d      a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；
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      d.然后分别回收你想要的片段进行连接。
( C: i! O; G$ }
6 e, \) f" d& V3 k) Y     这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
( Q0 U2 v. n) Y$ s1 L( K! l, l2 k- P# X- |  ]' i& i
    这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。

djj01

如果有起始密码，反向表达的多肽序列也是无意义的。。。

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 9 [* w% A* m% \4 h( K. I
( m- v( A; I, q" j" o) w2 Z

/ `  Y/ ~# Z/ j- B. B1 B    太感谢你了！想不到你这么热情，我很感动！

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼
  G, I  z3 T  W" i
( I% |7 J% e3 [+ s3 {9 K+ ?( l! B* D1 o$ h, R' j
    能把你的联系方式如QQ告诉我吗？我想以后请教就方便了！

sidalin301

反正就2种结果，方向相反和不相反，我先接上看会不会表达再说，如果不会就是反了，再从新接。
5 i. y4 B7 l+ H% `) N- S* ^! n谢谢大家的热心帮助！

shiqingxi

选的酶不同应该是不会顺序相反的，质粒构建完成后，需要鉴定，测序什么的应该可以避免你这种问题的。