请教一个双酶切的问题

深海寂寞鱼

0 H; B; t' v' E6 U& Y9 Z) \4 a$ o. P2 Z" ~) n
to sidalin301：) J' I6 T9 f$ k/ }) k
8 \: S7 [9 A0 |4 K2 r: x. X/ `. a
   你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。" g" w4 f. T2 f+ V9 O& E  g
$ y( g- s$ f$ q' L
  1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
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; X0 i9 f; w% \- w2 `2 ~+ @8 @      我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）6 n; S# r' g7 X6 D  u" j
      不知道你的质粒具体是其中哪一个？
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2010-10-19 13:11 上传

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* n. k6 i# N9 ~) v
6 y9 X+ C. a/ F2 \
  2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。; B6 E9 y0 s+ M4 e4 A+ o! ~
      希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。
8 ], ~2 \) H# b) n8 f' {- e
# o0 P" c2 I7 o) m' }  3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
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      如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。0 A% _2 Y# W; g# O/ {8 i

3 g2 F0 g0 {, ^" y' M. ?      具体的步骤是：
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      a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；
' j; _; S  p4 [& z, w. j; }
8 M2 u5 H/ G& \- \/ w3 S6 n( A4 U1 G      d.然后分别回收你想要的片段进行连接。
3 B. e; Z. s( }5 \& c# W% _" w' W2 [4 f  m
     这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
0 g) [3 M3 u- C" X- \' k+ ]& B
5 ?7 ~( x7 H8 [: T2 Y! ]    这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。

djj01

如果有起始密码，反向表达的多肽序列也是无意义的。。。

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼
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+ |! t  A, P5 y- P8 B7 @- m/ o, t; }9 f9 y# I
    太感谢你了！想不到你这么热情，我很感动！

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼
  [- |. U. S1 |0 N, H" _% S/ U3 m, ^/ S$ R, g0 u! |9 y0 o1 W& b+ G
, w* D! U' M# u: k
    能把你的联系方式如QQ告诉我吗？我想以后请教就方便了！

sidalin301

反正就2种结果，方向相反和不相反，我先接上看会不会表达再说，如果不会就是反了，再从新接。
$ l8 T0 A- {2 N& B谢谢大家的热心帮助！

shiqingxi

选的酶不同应该是不会顺序相反的，质粒构建完成后，需要鉴定，测序什么的应该可以避免你这种问题的。