骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠的治疗作用



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发表于 2009-3-3 12:27 |显示全部帖子

作者：赵峰　张宇飞　马福成　李志奎　吴昌归　戚好文作者单位：第四军医大学西京医院：1呼吸内科，2病理科，陕西西安 710033 % B: A+ R! r$ o

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      【摘要】  目的: 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠肺损伤的治疗作用. 方法: 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内. 将受体大鼠分为4组：肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组和正常对照组. 2 wk后观察肺组织结构、植入细胞的变化，同时检测支气管肺泡灌洗液中层黏连蛋白、透明质酸以及肺组织羟脯氨酸含量的变化. 结果: MSCs治疗组大鼠肺组织中可见少量DAPI标记的细胞，其中部分细胞表达广谱细胞角蛋白，肺间质增生减轻；支气管肺泡灌洗液中层黏连蛋白、透明质酸及肺组织羟脯氨酸的含量在肺损伤组均有明显升高（P
      【关键词】骨髓;间充质干细胞；肺损伤；分化；治疗
   　　Therapeutic effect of bone marrowderived mesenchymal stem cells on injured lung of rats

　　ZHAO Feng, ZHANG YuFei, MA FuCheng, LI ZhiKui, WU ChangGui, QI HaoWen% v( G9 q4 S+ M

　　1Department of Respiratory Medicine, 2Department of Pathology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
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　　【Abstract】 AIM: To investigate the therapeutic effect of bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) on injured lung of rats.METHODS: MSCs were isolated from SD rats and injected into recipient rats after labeled with 4′6Diamidino2phenylindole (DAPI). The recipient rats were divided into 4 groups: lung injury group, MSCs treatment group, MSCs control group and normal control group. Lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected 2 weeks after implantation. Cells which were labeled with DAPI and pancytokeratin positive were detected under fluorescence microscope. Lung structure, fibroblasts in interstitium were observed. The contents of hydroxyproline in lung and laminin, hyaluronan in BALF were detected.RESULTS:MSCs from donor could be found in injured lung of recipient rats and some of them were found pancytokeratin positive. The thickness of alveolar wall and the number of fibroblast in lung interstitium were reduced significantly in MSCs treatment group. MSCs engraftment could also reduce the contents of laminin and hyaluronan in BALF and hydroxyproline in injured lung (P# Y5 n' r' s6 A( o, R
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　　【Keywords】 bone marrow; mesenchymal stem cells; lung injury; differentiation; therapy

　　0引言4 @' h. I5 ^* s, s. J8 z

　　骨髓间充质干细胞（MSCs）是成体干细胞的一种，在一定条件下可分化为多个胚层来源的组织细胞［1］. 近年的研究发现小鼠MSCs异体移植后可在损伤的小鼠肺组织中存活并分化为肺泡上皮细胞，减少肺组织胶原的沉积，为肺纤维化的治疗提出了一个新的思路［2-3］. 我们应用博来霉素（BLM）诱发的大鼠肺损伤模型，观察MSCs在大鼠肺组织中的分化及对肺组织细胞外基质层黏连蛋白（LN）、透明质酸（HA）的影响，为将MSCs用于肺损伤及纤维化的治疗提供实验依据.' w) W& }3 U  z' g3 z3 w. h

　　1材料和方法# s0 `; V" ^& W- _

　　1.1材料

　　雄性SD大鼠1只，体质量100～150 g；雌性SD大鼠20只，体质量200～250 g（第四军医大学实验动物中心）；DAPI （4,6二乙酰基2苯基吲哚，Roche公司）；小鼠抗大鼠广谱细胞角蛋白（PCK）mAb（Santa Cruz公司）；羟脯氨酸（HYP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；LN，HA放免试剂盒（上海海军医学研究所）；DG3022型酶联免疫测定仪（南京华东电子管厂）.

　　1.2方法

　　1.2.1MSCs的培养、鉴定参考文献［4］方法. MSCs取自雄性SD大鼠骨髓. 将获取的大鼠股骨、胫骨骨髓用1073 g/L的Percoll分离液分离，用含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12悬浮细胞，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养. 48 h后弃掉未贴壁细胞，细胞长到80％融合时消化，1∶3传代，扩增培养，通过多次传代对细胞进行纯化. 取第3代细胞，流式细胞仪检测CD34，CD44，CD45及CD166的表达.! L  _  c9 Z' ~# n# F: u
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　　1.2.2细胞标记取3～10代的大鼠MSCs，加入无菌的DAPI至终浓度为50 g/L，37℃孵育30 min，离心后PBS反复洗涤6次以去除未结合的DAPI. 离心收集细胞，用无血清DMEMF12稀释至11010/L，放于冰浴中，1 h内将细胞注入受体大鼠体内.# b& u$ d5 @" ]1 i6 k

　　1.2.3实验动物及分组受体动物为雌性SD大鼠，分为4组，每组5只：①肺损伤组：每只大鼠经气管注入BLM 5 mg/kg（0.2～0.3 mL），12 h后经尾静脉注射无血清DMEMF12 0.5 mL；②MSCs治疗组：BLM注射同肺损伤组，12 h后经尾静脉注射DAPI标记的MSCs，5106/只(0.5 mL)；③MSCs对照组：大鼠气管内注入等体积生理盐水，MSCs注射同MSCs治疗组；④正常对照组：大鼠经气管注入等体积生理盐水，12 h后经尾静脉注射等体积无血清DMEMF12. 2 wk后处死大鼠，取肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）.
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　　1.2.4形态学观察大鼠左肺常规HE染色，观察肺组织结构的变化. 右肺行冰冻切片（25μm），免疫荧光染色SABC法检测PCK的表达. 一抗为小鼠抗大鼠PCK mAb，二抗为生物素化的山羊抗小鼠IgG，Cy3显色. 阴性对照用0.01 mmol/L PBS代替一抗，荧光显微镜下观察. 剩余肺组织-70℃冻存.& ?& k, c5 F* p+ B" g* p* H' W' P7 m

　　1.2.5大鼠BALF中LN，HA含量测定左肺上叶用37℃无菌生理盐水行支气管肺泡灌洗，放免法检测BALF中LN，HA含量.  Y* s6 H  L" d2 \+ N
5 e+ p+ s2 Z: A4 z' J" U
　　1.2.6大鼠肺组织HYP含量测定取冻存的肺组织制成20 g/L组织匀浆，按说明书方法测定HYP含量.8 M+ T+ a( g  x( t$ P5 n2 W$ O& L
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　　统计学处理：所有数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，不同组间的两两比较用SNKq检验.% F7 i0 R9 v9 `0 x; l

　　2结果( Z% O- r' ^( L( C. r
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　　2.1MSCs的培养、鉴定从骨髓分离的MSCs接种后贴壁生长，为单个圆形细胞. 1 wk后细胞大部分为梭形及纺锤形，并可见多角形. 传代后，细胞显示为均匀的梭形，增殖明显增快. 流式细胞仪检测结果显示培养的第3代大鼠MSCs表达CD44(71.5%), CD166（83.2%），而CD34，CD45不表达，表明获得的细胞为骨髓间质来源的干细胞.
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　　2.2大鼠肺组织形态学观察BLM注射2 wk后，HE染色可见正常对照组及MSCs对照组大鼠肺泡腔均匀、完整. 肺损伤组大鼠肺组织肺泡结构破坏，肺泡大小不均，间隔增厚，间质中成纤维细胞增多. MSCs治疗组大鼠肺组织肺泡结构仍有破坏，间隔轻度增厚，较肺损伤组有所减轻（图1）.1 H; |& k6 j3 V

　　2.3MSCs在大鼠肺组织中的分布、分化MSCs用DAPI标记后，荧光显微镜下胞核显示为蓝色，胞质不显色. 将标记的MSCs注入受体大鼠2 wk后，荧光显微镜下可见MSCs治疗组大鼠肺组织中有少量蓝色荧光标记的细胞，胞核椭圆形，细胞分布散在，无明显规律，而肺损伤组、正常对照组及MSCs对照组大鼠肺组织均未发现蓝色荧光标记的细胞. 免疫荧光化学染色可见各组大鼠肺组织肺泡壁、支气管壁均有大量红染的PCK阳性细胞，而MSCs治疗组大鼠肺组织中，可发现少量胞核为蓝色的细胞同时胞质显示为红色，即植入的MSCs也表达PCK，提示供体来源的MSCs在受体肺组织内可分化为上皮细胞（图2）.

　　2.4大鼠BALF中LN，HA含量的变化BLM注入大鼠气管2 wk后，肺损伤组大鼠BALF中LN，HA含量较正常对照组明显升高，MSCs治疗组则较肺损伤组显著降低，但未恢复到正常水平（表1）.表1大鼠支气管肺泡灌洗液中黏连蛋白和透明质酸含量的变化(略): r4 V( k/ |  F6 d- K
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　　2.5大鼠肺组织HYP含量的变化BLM注入大鼠气管2 wk后，肺损伤组大鼠肺组织HYP含量［(3.30±0.42) mg/g］较正常对照组［(1.32±0.29) mg/g］明显升高(P

　　3讨论
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　　我们将DAPI标记的MSCs植入BLM诱发的肺A: 大鼠肺组织内可见蓝色的细胞核(DAPI标记); B: PCK免疫荧光染色可见肺泡上皮细胞呈红色(Cy3标记); C: 肺损伤大鼠肺组织内可见同时具有蓝色胞核和红色胞质的细胞. A，B，C为同一视野，箭头所指为同一细胞.- _! _, l* Y1 l" X! c- G) h
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　　损伤大鼠体内，2 wk后发现MSCs可在损伤的大鼠肺组织中表达上皮细胞特有的PCK，即可分化为肺泡上皮细胞，而未经BLM作用的正常大鼠植入MSCs后并未在其肺组织内发现MSCs的标记. 虽然不能排除MSCs注入正常大鼠后也可在其肺内存活而仅仅由于存活量极少而未被检出，但说明肺组织的损伤为MSCs植入后的存活并分化为肺泡上皮细胞提供了重要的条件. Ortiz等［3］在研究中发现正常小鼠体内植入异体MSCs后在其肺组织中也可发现少量MSCs存活，但数量明显低于BLM作用过的小鼠，由此得出的BLM可有效促进异体MSCs在小鼠肺组织的存活及分化的结论与本研究相一致.: @/ A, N: m7 Q8 C, s( t0 j1 _
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　　MSCs分化为其他类型的组织细胞的机制尚不清楚. 目前多认为MSCs的分化受其所处微环境的影响和制约［5］. BLM可引起肺泡上皮细胞DNA断裂、细胞肿胀、变性、坏死，肺内出现炎症，大量炎性细胞浸润，TNFα，TGFβ等细胞因子大量产生［6］，而这些变化所引起的细胞生存所依赖的微环境的改变有可能使得MSCs在肺组织中聚集并最终分化为肺泡上皮细胞. 有研究发现，BLM还可使肺微血管扩张，内皮细胞损伤和收缩，内皮细胞间隙增宽，这在理论上使得MSCs从肺微血管内进入到肺组织及肺泡腔内成为可能［7］. Tremain等［8］发现MSCs不仅含有编码间质组织成分的基因，还含有编码内皮及上皮组织的基因，为其具有多向分化潜能提供了理论依据.; O! V9 T, ^% D: i: }

　　LN和HA是肺组织细胞外基质的重要成分，对维持肺组织结构具有重要作用. 肺组织损伤后，大量炎性细胞浸润，细胞因子释放，刺激多种细胞分泌LN，HA，而LN，HA的增加也可刺激巨噬细胞、淋巴细胞分泌多种细胞因子，促进基质的粘附、聚集，加快肺纤维化的形成［9-10］. HYP是胶原纤维中特有的一类氨基酸，在弹性蛋白中极少，其他蛋白中不存在，其含量的测定可换算出胶原蛋白的含量，用来表示胶原代谢的情况，判断组织纤维化的程度. 我们在研究中发现MSCs可有效降低肺损伤大鼠肺组织HYP及BALF中LN，HA的含量，进一步明确了MSCs可有效减轻肺损伤及肺纤维化，但此作用与MSCs在肺损伤大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞的关系尚需更深入的研究.; Q# v* z$ v5 X& X! y- H4 k3 O( Y
      【参考文献】
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　　［8］Tremain N, Korkko J, Ibberson D, et al. MicroSAGE analysis of 2,353 expressed genes in a single cellderived colony of undifferentiated human mesenchymal stem cells reveals mRNAs of multiple cell lineages ［J］. Stem Cells, 2001, 19(5): 408-418., r) y0 P, ~* F) k- a

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　　［9］Savani RC, Hou G, Liu P, et al. A role for hyaluronan in macrophage accumulation and collagen deposition after bleomycininduced lung injury ［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 23(4): 475-484.
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　　［10］Kuhn C, McDonald JA. The roles of the myofibroblast in idiopathic pulmonary fibrosis. Ultrastructural and immunohistochemical features of sites of active extracellular matrix synthesis ［J］. Am J Pathol, 1991, 138(5): 1257-1265.