全身照射引起间充质干/祖细胞池缩小及成骨潜能改变



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发表于 2009-3-3 12:28 |显示全部帖子

作者：马杰，陈斌，王宏兰，李静，史明霞，李炳宗，胡建立，赵春华作者单位：中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院组织工程研究中心，北京 100005 2 w6 M; ]" T/ u% b; q5 s' q6 @
   * Q/ z( x8 t7 Y/ h8 ]; M) ~
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      【摘要】  　　为了研究辐射对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC）数量及成骨分化潜能的影响，探讨BMMSC在辐射损伤中的反应及其与照射后造血和骨骼系统长期损伤的关系，用全身照射（total body irradiation, TBI）小鼠模型观察TBI前后不同时间点小鼠骨髓纤维母细胞集落形成单位（colonyforming unitfibroblast, CFUF)的改变及BMMSC细胞周期分布情况；用Von Kossa染色法测定钙盐沉积,实时定量RTPCR检测成骨分化相关基因及成骨转录共刺激因子TAZ (transcriptional coactivator with PDZbinding motif)的表达变化。结果显示：TBI后骨髓CFUF数量明显减少；TBI后3天较多的BMMSC进入细胞周期并且其成骨潜能明显增强，随后细胞周期分布恢复正常，但成骨潜能明显降低，同时伴有TAZ表达改变。结论：TBI能导致小鼠骨髓间充质干/祖细胞池的显著缩小并改变BMMSC的成骨分化潜能，TAZ表达的变化可能在其成骨潜能的改变中发挥一定作用。
      【关键词】全身照射；骨髓间充质干细胞；成骨潜能；TAZ
   　　 Reduction of Bone Marrow Mesenchymal Stem/Progenitor Cells Pool and Alteration of Their Osteogenesis Potential Caused by Total Body Irradiation
& N+ n5 g- P: J6 B5 d
MA Jie，CHEN Bin，WANG HongLan，LI Jing，SHI MingXia，LI BingZong，HU JianLi,% K  D9 D/ M# G: _" y( v+ V. Z

ZHAO ChunHua1 @+ A  @) H& Z! ?5 I0 O4 G

Center of Tissue Engineering , Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences,School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China% L* q6 \! o/ C! c9 R
: L- L( |- t6 s! D3 y# ~
AbstractTo investigate the effect of irradiation on the quantity and osteogenesis potential of BMMSCs and to explore the response of them in the irradiation stress and its contribution to longterm effects of radiationinduced bone and hematologic injury, a total body irradiation (TBI) murine model was adopted. The number of CFUF and cell cycle profile of BMMSCs were analyzed at different time points before and after TBI. Osteogenic differentiation was evaluated by Von Kossa staining,expressions ofosteogenesisrelated genes and transcriptional coactivator with PDZbinding motif (TAZ)were detected by realtime RTPCR. The results showed that the number of CFUF decreased greatly at day 28 after TBI. At day 3 after TBI， more cells entered cell cycle and the osteogenesis potential was greatly enhanced followed by recovery of cell cycle distribution and signifiacant defect in osteoblast differentiation respectively,meanwhile the expression of TAZ was changed. It is concluded that TBI results in the reductionof bone marrow mesenchymal stem/progenitor cell pool and alters the osteogenesis potential of BMMSCs,which is related to the change of TAZ expression.9 L2 ]8 _7 Q& W' l8 D' y3 J% T( c

Key wordsTBI；bone marrow mesenchymal stem cell; osteogenesis potential; TAZ- j. e/ W" L7 t0 o+ H! |
7 Q2 J! j$ r, `2 f7 V$ X( |
J Exp Hematol 2007; 15(2):313-3186 V" i- W( u! A# h. K( M7 b

放射治疗在目前仍是肿瘤治疗中的一个重要手段，但是这种治疗方法并非是肿瘤特异性的，正常组织尤其是造血和骨骼系统极易受到损害。随着接受放射治疗的肿瘤患者生存状况的改善，对放射治疗导致的一些远期毒副作用机制的探讨显得尤为重要。以往多认为造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）的凋亡［1,2］、自我更新能力及HSC池的缩小［3,4］和成骨细胞、破骨细胞的改变［5］分别是照射后造血和骨骼系统损伤的机制。然而造血功能的维持不仅与造血细胞本身有关，还与造血微环境息息相关，而骨容量的调控尤其是在病理条件下的调控皆依赖于足够的成骨干/祖细胞的存在［6］。骨髓中与HSC共存的BMMSC不仅能生成骨髓微环境中的大多数细胞，并且是成骨细胞的来源。此外，BMMSC因其多向分化潜能、分泌多种细胞因子及强的免疫调节功能，在损伤等病理生理情况下参与组织修复。因此，本研究利用全身照射的小鼠模型研究辐射对BMMSC的影响，并从BMMSC水平初步探讨放射治疗后一些远期损伤的可能机制。- ~" V# L" d9 C( b4 {
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　材料和方法

实验动物及辐射损伤模型制备) _. M% C( A; Z, @$ ?

5周龄雄性C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，实验动物随机分为正常对照组和全身照射组，后者经137Cs射线进行一次性全身照射4.0 Gy，吸收剂量率为2.4 Gy/min。每批动物分别在照射后的0、1、3、7、14和28天取股骨和胫骨，所得到的BMMSCs分别命名为D0，D1，D3，D7，D14和D28。
( A$ D2 y( z2 L$ D
主要试剂和仪器0 t" j4 N2 \" p
" K1 K+ p, B" O9 Y' V2 ~
FicollPaque分离液为Pharmacia公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.125%胰蛋白酶均购自Gibco公司，DF12、MCDB、地塞米松、β磷酸甘油钠、抗坏血酸均购自Sigma公司，Flk1 抗体购自Santa Cruz 公司，CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b 抗体购自晶美生物工程有限公司，TRIzoL为Invitrogen公司产品，5Buffer、 RTdNTP、逆转录酶、RNase抑制剂、OligdT均购自TaKaRa公司；realtime试剂盒购自Qiagen公司，流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品，realtime PCR仪（ABI PRISM7500）为Applied Biosystems公司产品）。% w0 [1 e) r& Y, O
  e3 F  g3 V, S4 B1 |8 D0 ?
小鼠骨髓单个核细胞的制备和BMMSC的分离及培养

无菌状态下取雄性C57 BL/6小鼠的股骨和胫骨，用4号针头反复冲洗，将冲出的骨髓，制成单细胞悬液。用FicollPaque(1.077 g/ml)分离出单个核细胞（bone marrow mononuclear cells, BMMNC）并计数，应用MACS CD45，GlyA和CD34磁珠去除其中的造血细胞,以107/ml的细胞密度接种在25 cm2 的培养瓶内。培养液成分为40% MCDB、55% DF12、4%胎牛血清、100 U/ml青霉素和1 000U/ml链霉素,置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱培养。24小时后去掉悬浮细胞,细胞融合达70%时，用0.125 %胰酶消化并以1∶2比例传代。这些细胞的免疫表型传代30次以上始终保持CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b阴性, Flk1阳性(资料未显示)，因而我们称之为Flk1 MSC。8 f: G  w5 O& A/ Z) K4 Z8 M, @& Y! l

CFUF计数
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以2105/cm2 的密度将BMMNC接种在25 cm2的培养瓶中。在37℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱内孵育，每3天换液1次，在第9天去掉培养液，用DHank 液洗2遍，甲醇固定后，结晶紫染色。在100倍倒置显微镜下计数，大于50个纤维母细胞样的细胞集落才被认为是CFUF。4 S& e+ u' G- |

细胞周期测定

于细胞生长的对数期消化细胞并测DNA的含量。细胞首先用70%的冰乙醇4℃固定过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，然后用40μg/ml的RNase A 37℃孵育20分钟，加入3 μg/ml 碘化丙锭，室温孵育5分钟，用流式细胞仪测定。

成骨的定向诱导分化和鉴定
3 k. R+ z4 r7 S% T/ y
以2104/cm2的密度将细胞加入成骨诱导培养液(含10%胎牛血清、1.010-8 mol/L地塞米松、2.010-4mol/L抗坏血酸、7.010-3mol/L β磷酸甘油的IMDM)，每3天半量换液1次，每天观察1次。用Von Kossa 染色检测钙质沉积，即中性甲醛固定1小时后，去离子水冲洗，加入2%硝酸银溶液，37℃避光反应10分钟，去离子水冲洗后爆光15分钟，光学显微镜下观察钙化基质沉淀。! s( h6 ~# @3 t

RNA的提取和逆转录
3 P# l0 b0 S) A& d
取体外扩增的小鼠BMMSC及扩增后成骨诱导的细胞按照TRIzoL说明书提取细胞总RNA。每瓶贴壁细胞加1ml TRIzoL液裂解，加0.2 ml三氯甲烷，冰浴后12 000g离心10分钟。上层水相移出后加异丙醇500 μl 12 000g离心10分钟。75％乙醇洗RNA1次。将RNA配成30 μl逆转录体系（5Buffer 6 μl, RTdNTP 2 μl, 逆转录酶1 μl，RNase抑制剂1 μl，OligdT 3 μl，DEPC水17 μl）。9 ^% |+ x. n0 k  E
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RTPCR
) Y- H$ ]& |% C1 p* ?1 O4 f
Realtime RTPCR前，cDNA产物在20 μl体系中行PCR以检测成骨指标，如Cbfa1（corebinding factors）/Runx2、Ⅰ型胶原（type 1 collagen，Col1）、骨钙蛋白（osteocalcin, OC）、成骨蛋白(osteopontin, OPN)和TAZ的表达。反应条件为：95℃ 5分钟，94℃ 40秒，58℃-62℃ 40秒，72℃40秒，循环32次，最后72℃延伸7分钟。引物及其相应退火温度如表1。

荧光实时定量RTPCR（real time RTPCR）4 l0 D, x! B6 `1 f' K# k# t
1 C+ W0 m' h6 E& f
Realtime RTPCR测定正常及照射后1、3、7、14和28天小鼠BMMSCTAZ的表达及上述的BMMSC体外成骨诱导1周或3周后成骨相关基因Cbfa1、Col1、OC和OPN的表达。以βactin为管家基因，应用嵌入荧光染料SYBR Green I进行荧光定量PCR扩增。扩增体系为20 μl，含2Premix 10 μl, 上游和下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，DEPC水7μl。扩增条件为：95℃ 15秒，94℃ 15秒，58℃-62℃ 30秒，72℃ 40秒，40个循环，引物及退火温度如表1。0 u- |* V, r2 Z( G' C, H
( r1 z% H3 v' a
统计学处理

应用SPSS软件分析数据，两样本均数间比较采用t检验。P
9 a5 y. _. l9 C( K
结果4 p: A3 }! }0 r1 y

TBI后骨髓间充质干/祖细胞池缩小
5 s; b- M8 d4 u+ w: \6 k
预实验中我们发现，小鼠接受不同剂量（2、 4、 6.5 和 8 Gy）的TBI后，BMMNC和CFUF的数量改变呈剂量和时间依赖性。我们选择4 Gy作为TBI的剂量进行下面的实验。如图1所示，4 Gy TBI后BMMNC迅速降低，在TBI后第3天达最低点，此后逐渐恢复，在TBI后28天基本恢复至正常水平（图1A）。而CFUF/106 BMMNC在第3天最高，然后逐渐下降，至第28天仍未见恢复的趋势（图1B）。分析每只小鼠后肢中所含CFUF，我们发现，虽然CFUF的绝对数量在TBI后第3天稍有回升，但其后表现为长期的降低，4周内未见恢复（图1C）。* r2 O3 n& C* f' M, O, G

Figure 1.Reduction of BM mesenchymal stem/progenitor cell pool caused by TBI. A: BMMNC/ hind legs; B: CFUF/106 BMMNC; C: CFUF/2 hind legs. The data are expressed as means±SD (n=3). **P

TBI对BMMSC细胞周期的影响8 H" y1 @5 X. ^! g* ~, {

用流式细胞仪检测正常及TBI后3、7和28天BMMSC细胞周期分布，结果如图2和表2所示。正常情况下（86.1±2.64）% BMMSC处于G0/G1期，在TBI后第3天较多细胞进入S期(P=0.002)，但在TBI后28天BMMSC细胞周期的分布又恢复至正常。7 H4 M0 y! X& h4 x! P

TBI后BMMSC的体外成骨潜能的变化" T! k* a0 @( v. _4 A
7 o, M  ~. X3 U2 Y% K+ Y' Q- q
如图3所示，TBI前后不同时间点BMMSC在成骨诱导培养液中诱导3周后，进行Von Kossa染色发现其成骨潜能明显改变。TBI后3天成骨潜能明显增强，而TBI 7天后则明显下降，分别表现为黑色矿化物沉积的明显增多和减少。4周内成骨潜能未见明显恢复。+ c( k# V5 J: v1 a; U

TBI后BMMSC成骨分化相关基因的表达

TBI后一些成骨相关基因的表达呈时间依赖性，并与体外诱导时限相关。如图4 A和B所示，体外成骨诱导1周，核心结合因子1 （corebinding factor 1，Cbfa1）、Ⅰ型胶原（type 1 collagen，Col1）和骨钙蛋白（osteocalcin， OC）在TBI后3天BMMSC中表达最高，在TBI后28天表达最低。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达同样在TBI后3天最高，但其余时间点的表达与正常均无差异。而在成骨体系中培养3周，TBI后3天BMMSC Cbfa1的表达仍然最高，不同的是Col1和OC的表达在TBI后28天达高峰，TBI后3天最低。TBI后不同时间点OPN的表达与正常无差异。  `9 C# e8 m6 X2 t- D, h

TBI后BMMSC TAZ的表达6 R9 h' \& {! c
5 e7 o  }+ m9 `; E. X  [; z. W4 ~
Realtime RTPCR 方法检测 TBI 前后不同时间点BMMSC TAZ的表达，结果如图4 C所示，TAZ在TBI后3天表达最高，但TBI后7天明显降低，4周

内其表达未见恢复。- O+ Z4 ?9 @" w7 e1 L
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讨论2 X) Y) T: D& x8 `8 }/ K% W

近年来，在充分认识MSC的生物学特性后，有关MSC，尤其是BMMSC在损伤、疾病及衰老等病理生理情况下所发挥的作用和其在再生医学中的应用都取得了较多进展。重要的是，一些研究显示BMMSC在某些疾病的发生发展中也起着重要作用［7,8］，在本研究中我们也发现TBI后骨髓间充质干/祖细胞池明显缩小，体外成骨潜能改变显著。9 ^+ h4 w2 _( g1 p3 J% D' p" Z: g9 f

CFUF是一种对间充质干/祖细胞总数进行量化的检测方法［9］。通过对TBI前后CFUF的监测，我们发现TBI对BMMSC的影响首先表现为间充质干/祖细胞池的缩小。虽然通过凋亡的早期检测方法Annexin V分析，我们没有观察到BMMSC的明显的凋亡（结果未显示），但这一结果并不能排除TBI后体内BMMSC发生凋亡。干细胞的自我更新能力在维持干细胞池的稳定中发挥重要作用，因而TBI后骨髓间充质干/祖细胞池的缩小是否源于BMMSC自我更新能力的改变还需进一步研究。) T0 k: }0 v% n( J

除了BMMSC数量的改变，通过Von Kossa染色和成骨分化相关基因表达的分析我们发现，TBI能显著改变BMMSC体外的成骨潜能。只有完全成熟的成骨细胞才能产生基质并矿化。Cbfa1是成骨分化的重要调控因子，能调控分化的成骨细胞骨沉积的速率［10-12］，TBI后Cbfa1表达的变化与Von Kossa染色结果是一致的。Col1是成骨分化过程的早期标志之一，它在成骨分化早期被诱导表达，在钙质沉积将结束时表达降低［13］，而OC是分化成熟的成骨细胞的标志，仅表达于完全分化的成骨细胞，而在成骨分化的终末阶段即分化至骨细胞和骨衬细胞（bone lining cells）时则不表达［14］。体外成骨诱导1周时， TBI后3天BMMSC的上述成骨相关基因表达明显增高，提示TBI后早期成骨细胞分化过程加速。诱导3周即成骨细胞分化以成熟基质矿化为特征时，TBI后28天BMMSC不仅缺乏应有的钙质沉积（Von Kossa结果所示），其成骨分化相关基因Col1和OC高表达，提示分化的成骨细胞仍然处于一个早期的不成熟的阶段。而此时TBI后3天BMMSC的Col1和OC量明显降低，这可能反映了成骨细胞已分化至终末阶段即分化为骨细胞。OPN是骨基质形成时的另一个标志，成骨分化过程中它的表达呈双峰，即首先表达于活跃的细胞增殖期，然后降低，在细胞开始矿化时表达再次增高［15］。这一表达的双时相性可能是TBI后OPN表达变化不显著的原因。TAZ是一种转录因子，通过WW模体结合于Cbfa1/Runx2的PPPY结构域而产生共激活作用［16］，进而调节MSC向成骨分化而抑制成脂分化［17］。我们的研究结果显示，TBI后BMMSC TAZ的变化趋势和Cbfa1的一致，这种变化在向成骨诱导前就已经存在。以上这些结果说明，TBI干扰了成骨细胞的分化过程，损伤的早期BMMSC成骨分化潜能明显增强，而最终成骨细胞生成受阻，TAZ的表达变化可能是导致这一变化的原因之一。
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正常情况下体内的干细胞处于静止状态，在机体受到应激或损伤时它们将重新进入细胞周期促进组织的再生与修复［18］。我们观察到的TBI后早期更多的BMMSC进入细胞周期及成骨潜能的增强提示，在放射损伤的早期BMMSC通过增殖能力和成骨能力的增强来尽力维持机体内环境的稳定，但是BMMSC的这种代偿功能是有限的。成骨细胞不仅在骨骼系统的维持中发挥重要作用，它还是骨髓造血龛位（niche）的重要组成成分［19］，因而TBI所导致的骨髓间充质干/祖细胞池的缩小及其成骨分化潜能的降低使成骨细胞的分化明显受阻，这可能是放射损伤后造血和骨骼系统远期功能障碍的干细胞水平的机制。
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