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若是25cm2的培养瓶90%-100%铺满:6 S' T4 E3 L& t% O: y; B
1.洗涤:弃去旧培养液,PBS洗涤1-2次(目的是去除旧培养基中的血清成分和细胞的有害代谢产物)。/ }0 J) y) I T. E; S* Y
2.消化:方法一:直接加入1ml0.25%胰酶,轻轻晃动至胰酶完全铺满瓶底,消化1min时镜下观察有个别细胞浮起来即刻弃去胰酶,加入新鲜的培养基(含血清)终止消化,拿吸管反复吹打瓶底形成均匀的细胞悬液即可。% S9 H6 |" h2 C$ D. l3 g
方法二:洗涤后弃去PBS,再次加入新鲜的PBS约1ml,加入0.25%胰酶300-500ul,晃动铺满瓶底,消化5-8分钟,镜下观察细胞部分浮起即刻终止消化。
( z% P- }" Z8 |3 [+ i8 d C, C( v7 |注意:1.胰酶在37°下提前温育可促进消化但酶经加热再冻融活性大大降低,建议分装再使用该法,如果分装剂量为2-3次的使用量,建议室温自然融化,勿用手去融化;$ {) Q r6 b) f. Z% i0 d
2.终止消化有效成分是FBS,如果是完全培养基则无法即时终止消化;, q& @ m' }/ P7 I0 I
3.若冻存细胞建议使用第一种消化方法,若是传代或种板两种均可;: Y' F/ b5 E( {" ]+ L! a7 K7 J$ T
4.消化时动作尽量要轻柔,将细胞受损程度降到最低;' n; o4 M7 { N7 w/ p1 L" t, w
5.消化时间是经验之谈,要参考酶的具体活性以及细胞密度。 |
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