胰酶消化传代需要注意什么问题？

267318024

非常感谢！

zsc78

吸弃培养液后，用PBS漂洗1~2次，胰酶覆盖瓶底或孔底就可以了；消化时间跟你的温度和酶的活性有关，自己观察就是了。用血清或含血清的培养基终止消化。

cc1986

一般用前把胰酶放在孵箱里面十几分钟，提高酶的活性，消化时间不超过5分钟，镜下控制消化时间，细胞变圆，空隙变大就可以终止，加2倍体积的培养基终止，轻柔吹打,瓶底清爽了就差不多了。。。

若兰汀

若是25cm2的培养瓶90%-100%铺满：
4 r  U& O& v, [, ^' N- x8 X4 T8 J1.洗涤：弃去旧培养液，PBS洗涤1-2次(目的是去除旧培养基中的血清成分和细胞的有害代谢产物)。
6 {# g/ _8 J: H4 M- V& a2.消化：方法一：直接加入1ml0.25%胰酶，轻轻晃动至胰酶完全铺满瓶底，消化1min时镜下观察有个别细胞浮起来即刻弃去胰酶，加入新鲜的培养基（含血清）终止消化，拿吸管反复吹打瓶底形成均匀的细胞悬液即可。
! s5 h/ Y* R, `$ L方法二：洗涤后弃去PBS，再次加入新鲜的PBS约1ml，加入0.25%胰酶300-500ul，晃动铺满瓶底，消化5-8分钟，镜下观察细胞部分浮起即刻终止消化。
7 i" Q5 e  X9 |6 \9 f( y注意：1.胰酶在37°下提前温育可促进消化但酶经加热再冻融活性大大降低，建议分装再使用该法，如果分装剂量为2-3次的使用量，建议室温自然融化，勿用手去融化；% E8 S4 F" o. X1 S
2.终止消化有效成分是FBS，如果是完全培养基则无法即时终止消化；6 z" B/ _3 D9 P/ e/ K: p9 Q7 Q
3.若冻存细胞建议使用第一种消化方法，若是传代或种板两种均可；
6 N& m  q- |5 k. x' v+ C4.消化时动作尽量要轻柔，将细胞受损程度降到最低；
9 o" L4 s+ y0 F1 Q2 N* U- T5.消化时间是经验之谈，要参考酶的具体活性以及细胞密度。

天幕琼花

我觉得最开始还是要摸清它的习性的 胰酶消化1-3min 每隔半min镜检 看是否变圆 之后停止消化 倒掉胰酶 加新鲜培养基就行了 也还胰酶新鲜程度有关吧 新配的 消化时间就短0 e; A+ }: `1 z& v7 y. v
慢慢摸好条件就行了 呵呵 祝顺利

王乾

先用PBS洗一下，加1ml的胰酶就行了，放到37度，准则是细胞刚刚从壁上脱落下来为好，然后加2ml DMEM（一定要含有血清），然后再用1ml的枪轻轻吹打几下，要把细胞尽可能的吹成单细胞，然后转移到15ml的离心管中1000转离心2分钟，去上清，重悬，按比例传代。

267318024

2006goodluck

建议加入胰酶中加入EDTA， 二价离子抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便减少抑制胰蛋白酶的活性。可以在胰酶中添加EDTA，以消除来自培养基中所有的二价离子。

2006goodluck

建议加入胰酶中加入EDTA， 二价离子抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便减少抑制胰蛋白酶的活性。可以在胰酶中添加EDTA，以消除来自培养基中所有的二价离子。

霄子

学习了~~哎，刚传代时时间过长，细胞几乎都漂起来了~~不知道会怎么样啊