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作者：李建生, 刘敬霞, 孙捷, 赵跃武, 苏静, 李宁, 郭晓燕作者单位：河南中医学院老年医学研究所, 河南 郑州 450008 河南省人民医院病理科, 河南 郑州 450003
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【摘要】 目的：观察大黄苷元对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)移植术后脑组织病理改变及基质金属蛋白酶的影响。方法：体外全骨髓细胞贴壁筛选培养法扩增BMSCs；线栓法制备大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型。190只大鼠随机分为假手术组、模型组、大黄苷元组、BMSCs移植组（简称移植组）和BMSCs移植联合大黄苷元组（简称联合组）。再灌注后24 h将BMSCs由同侧颈内动脉移植入移植组和联合组大鼠脑内；大黄苷元组和联合组予大黄苷元灌胃用药。移植后7、14和28 d，模型各组取脑组织用于检测。光镜下观察脑组织微血管病理改变；免疫组织化学法测定BMSCs免疫球蛋白抗体G(immunoglobulin G, IgG)、Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen, colⅣ）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9, MMP9）和金属蛋白酶组织抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP1）的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠微血管残缺、破损明显，脑组织中IgG和MMP9表达增强，ColⅣ和TIMP1表达减弱。与模型组比较，大黄苷元组、移植组和联合组大鼠微血管结构改善明显；大黄苷元组和联合组各时间点大鼠脑组织中IgG表达和MMP9活性减弱，ColⅣ和TIMP1表达增强。联合组大鼠于移植7 d时的微血管结构较移植组完整，其各时间点大鼠脑组织中ColⅣ表达较移植组增强，14 d时大鼠脑组织中MMP9活性较大黄苷元组降低，TIMP1表达增强，28 d时TIMP1表达较移植组增强。结论：大黄苷元可使脑缺血再灌注损伤大鼠微血管基底膜ColⅣ降解减少，通透性降低，并与BMSCs有协同作用，其作用机制可能与增加TIMP1表达以调节MMP9平衡有关。
7 m( o9 j3 m) [0 g) H: W5 | 【关键词】脑缺血 大鼠 大黄苷元 骨髓间充质干细胞 血脑屏障 基质金属蛋白酶- H( @5 n$ F u
Effects of rhubarb aglycone on matrix metalloproteinase in cerebral ischemic tissue in rats with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation
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Jiansheng LI , Jingxia LIU , Jie SUN , Yuewu ZHAO , Jing SU , Ning LI , Xiaoyan GUO/ p3 h9 |! K0 w9 _
5 ?' Q) ` M4 o' n5 q+ l& t Institute of Geriatrics, Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan Province 450008, China
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Department of Pathology, Henan Province People's Hospital, Zhengzhou, Henan Province 450003, China8 M8 o v; ~+ z& O
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Objective: To observe the effects of rhubarb aglycone on pathological changes and activity of matrix metalloproteinase in cerebral ischemic tissue in rats with bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) transplantation, and to explore the action mechanisms of rhubarb aglycone in protecting against brain micrangium injury in rats.
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$ c1 v3 _2 b$ g8 `) a8 U% u& u Methods: The BMSCs were purified and amplified by methods of adherence and selection in vitro. One hundred and ninety rats were randomly divided into shamoperated group, untreated group, rhubarb aglycone group, BMSC transplantation group (abbreviated as transplantation group) and BMSCs combined with rhubarb aglycone group (abbreviated as combination group). Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats of transplantation and combination group were transplanted with BMSCs via carotid artery after 24hour reperfusion. Rhubarb aglycone was used by intragastric administration in the rhubarb aglycone group and the combination group. The brain samples were taken at 7, 14 and 28 days after transplantation. Brain micrangium pathological changes were observed by light microscope, and immunohistochemical method was used to determine the expressions of immunoglobulin G (IgG), type Ⅳ collagen (Col Ⅳ), matrix metalloproteinase9 (MMP9), and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1).
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Results: Comparison with the normal control group revealed that brain micrangium in rats in the untreated group was obviously mutilated and damaged, the expression of IgG and MMP9 increased, and showed a progressively enhanced tendency following the prolongation of reperfusion, while the expressions of Col Ⅳ and TIMP1 were decreased, and TIMP1 showed a attenuated tendency following the prolongation of reperfusion. Comparing with the untreated group, the improvements of brain micrangium structure in the rhubarb aglycone group (7 days after transplantation), the transplantation group (14 and 28 days after transplantation) and the combination group were significant; expression of IgG and activity of MMP9 were decreased, while expressions of Col Ⅳ and TIMP1 were increased in the rhubarb aglycone group and the combination group at each time point. The brain micrangium was integral and the expression of Col Ⅳ was enhanced in combination group (7 days after transplantation) as compared with those in transplantation group. MMP9 activity in combination group (14 days after transplantation) was lower than that in the rhubarb aglycone group (14 days after transplantation), while expression of TIMP1 in combination group also increased significantly as compared with that in transplantation group (28 days after transplantation).
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) V% a- g+ ?) R Conclusion: Rhubarb aglycone can decrease the degradation of basal lamina Col Ⅳ and the permeability of brain micrangium in cerebral ischemic rats with BMSC transplantation, and its mechanisms may be related to regulating the balance of MMP9, especially by increasing the expression of TIMP1.
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Keywords: cerebral ischemia; rats; rhubarb aglycone; bone marrow mesenchymal stem cells; blood brain barrier; matrix metalloproteinase
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骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）具有分化为神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞的潜能，且能通过血脑屏障（bloodbrain barrier, BBB）。BMSCs移植被认为是治疗脑缺血再灌注损伤理想的新途径［1, 2］，其可通过多种途径对脑缺血再灌注损伤后血脑屏障破坏发挥保护作用，进而用于保护和修复受损的神经细胞。目前对BMSCs脑内移植保护血脑屏障的研究已有报道，但从基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）调节方面探索其作用机制的研究少见。中药可通过调节基质金属蛋白酶表达发挥血脑屏障保护作用［3］。大黄苷元为中药大黄Radixet Rhizoma Rhei的乙醚提取物，具有显著的抗脑缺血损伤作用［4］。前期研究表明，大黄苷元和BMSCs联合对脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用（另文待发表），本研究运用免疫组织化学法，从脑组织免疫球蛋白和微血管基底膜胶原的表达变化方面，动态观察BMSCs移植对脑缺血再灌注血脑屏障的保护作用，进一步从其对基质金属蛋白酶变化的影响方面探讨其可能的作用机制。
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1材料与方法
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1.1.1主要试剂与仪器兔抗大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG)抗体(1︰100，批号BA0385）、兔抗大鼠Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，Col Ⅳ)抗体(1︰100，批号BA0446）、兔抗大鼠MMP9抗体（1︰100，批号BA0573）、兔抗大鼠金属蛋白酶组织抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP1)抗体(1︰100，批号BA0575），武汉博士德生物工程有限公司产品。大黄苷元，河南中医学院药物分析学科提供，颗粒剂，生理盐水配制成混悬液，配制浓度为12.96 mg/ml；培养基DMEM/F12，GIBCO Invitrogen公司；胎牛血清（fetal calf serum，FCS），杭州四季青生物工程材料有限公司，批号为051126；0.25%胰酶，SigmaAldrich有限公司，批号为05401236。倒置相差显微镜，日本Olympus Optical有限公司，型号PM10AD；二氧化碳培养箱，美国Sheldon Manufacturing公司，型号T02323；超净工作台，苏州净化仪器厂，型号5WCJ1F；混纤维滤膜，上海瑞丽分离仪器厂吴泾分厂；细胞定量采集管，江苏求新玻璃仪器厂；图像分析系统ImageProplus 5.1，美国Media Cybernetics 公司，型号41N510044800。
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0 ?4 r# H4 F @7 t3 G* a3 a 1.2局灶性脑缺血动物模型的建立参照改良的Zea Longa法，线栓阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型［5］。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，颈前正中切口，左侧钝性分离颈总动脉（common carotid artery, CCA），分离颈内外动脉，穿线备用，结扎翼颚动脉，于颈外动脉近动脉分叉处剪口，栓线穿入颈内动脉，缓慢推进，直至感觉有阻力为止。穿线成功后留出残端，以备拔线进行细胞移植，缝合皮肤，并在切口处滴注青霉素钠溶液（40万U青霉素粉针剂加入4 ml生理盐水中配制，每次6滴）。手术过程中保持大鼠肛温37 ℃，术后腹腔注射青霉素钠盐，4万U/d，预防感染。假手术组不穿入栓线，其余操作相同。$ t" v3 U9 w* T% i
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1.3骨髓间充质干细胞培养、扩增与移植) c k, q6 q& G
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1.3.1骨髓间充质干细胞悬液制备将2月龄的雄性SD大鼠10只（SPF级，合格证号410117，体质量220～280 g）断颈处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，除去骨表面附着组织。用DMEM/F12培养液（含1万U肝素）10 ml反复冲洗骨髓，充分吹打混匀后加入5 ml DMEM/F12培养基，重悬，收集骨髓细胞悬浮液。% S6 ~: }( M+ c; t: C5 i* z( s3 M
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1.3.2骨髓间充质干细胞的培养与扩增于骨髓细胞悬浮液中加入含10% FBS的DMEM/F12培养液，置于5% CO2培养箱内，3～4 d换液1次，弃去未贴壁的细胞后继续培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长，待细胞基本长满瓶底时（>80%）加入0.25%胰酶消化，胎牛血清终止消化，结束原代培养。' S/ p0 a' r$ O
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1.3.3骨髓间充质干细胞的重悬、计数与移植移植前对细胞进行离心，收集，生理盐水漂洗3次，进行细胞计数，生理盐水重悬，使每0.2 ml生理盐水中的细胞数为2106个，单细胞悬液经颈内动脉移植入脑。; H" r" j$ \6 V4 r3 c
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1.4分组与用药190只SD大鼠按随机数字表法进行2次随机分组。第1次：分为假手术组与手术组。第2次：手术组大鼠根据干预方式不同分为模型组、大黄苷元组、BMSCs移植组（简称移植组）、BMSCs移植联合大黄苷元组（简称联合组），假手术组10只大鼠，其余各组均为45只。
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Z! s0 K0 s# F 术前4 d大黄苷元组和联合组分别给予大黄苷元12.96 mg/(kg·d)灌胃，假手术组、模型组和移植组以同等体积的生理盐水灌胃，1次/d。术后3 h缓慢拔出栓线进行再灌注；再灌注后24 h移植组和联合组颈内动脉给予BMSCs悬浮液0.2 ml，模型组和大黄苷元组颈内动脉给予0.2 ml生理盐水；移植后次日大黄苷元和联合组大鼠分别给予大黄苷元12.96 mg/(kg·d)灌胃，模型组和移植组大鼠给予同等体积的生理盐水灌胃，每周根据大鼠体质量调整灌胃药物的用量［6］，1次/d，直至取材。
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1.5处理与取材假手术组大鼠于术后第28天取脑组织，模型组、移植组、大黄苷元组和联合组大鼠根据取材要求的时间点分别于颈总动脉用药后7、14和28 d麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液经升主动脉进行灌注固定，取出全脑，用4 ℃生理盐水冲洗3次，除去积血，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑左侧半球，从额极向后5 mm处冠状切取脑组织2 mm，置入4%多聚甲醛溶液（pH 7.4），用于免疫组化测定。4 U9 \% Z' d$ M! ?7 S0 c
/ D( E* L5 e* u; i 1.6指标测定
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/ j4 n E( w- p; X8 U3 y 1.6.1病理观察常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察脑缺血中心区微血管完整性的变化。4 o. K4 k! U) C- Y1 D* e
/ E. q0 z" C: P& K 1.6.2免疫组织化学法检测IgG、ColⅣ、MMP9和TIMP1表达石蜡包埋，切片，脱蜡和水化，柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）微波加热修复，3%的过氧化氢阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，每张切片加1滴非免疫性动物血清（10%的正常山羊血清封闭液），室温下孵育10 min后滴加一抗（分别为1︰100的兔抗大鼠IgG、ColⅣ、MMP9和TIMP1），进行抗原抗体特异结合；滴加生物素标记的二抗（羊抗大鼠IgG生物素），室温下孵育30 min后再滴加链酶亲和素过氧化物酶；二氨基联苯胺显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。分别于显微镜观察（200）大鼠缺血侧脑组织IgG、ColⅣ、MMP9和TIMP1表达。每张切片随机选取缺血侧皮层5个视野，用图像分析系统ImageProplus 5.1进行图像采集（显微镜，200倍）；每幅图像采用盲法进行分析测量，设定图像分析系统的最大灰度分级为256，最大光密度值为2，阳性表达的灰度值与光密度呈反函数，灰度值的大小与阳性表达呈负相关，光密度值（即阳性表达吸光值）大小与表达强弱呈正相关；观察每视野表达阳性物质的神经元细胞数目，测定阳性表达的面积密度和平均光密度，计算整合光密度值（integration optical density, IOD）。计算公式：IOD=面积密度平均光密度；阳性反应IOD越大，表示反应越强。IgG阳性表达呈棕黄色，阴性呈蓝色；ColⅣ阳性表达呈黄褐色；MMP9和TIMP1阳性表达均呈棕黄色。
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1.7统计学方法用SPSS 11.0 for Windows软件进行统计处理。对数据资料进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析，不符合正态分布者进行数据转化后比较，计量资料数据用x±s表示。显著性水准取α＝0.05。! k3 N7 {+ V2 ?: h2 X, Z z( X
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2结果* l5 L/ i/ i; I$ V
5 b* H1 O: p( O2 E6 q' |: O 2.1一般情况实验大鼠于手术中维持呼吸、体温在正常生理范围。第1次手术后3 h大鼠可苏醒，第2次手术对麻醉药敏感，两次手术过程中，由麻醉直接引起17只动物死亡，其中假手术组、模型组、大黄苷元组、移植组、联合组各组7、14、28 d合计死亡动物只数分别为1、5、3、3、5只；剔除动脉推注药液后48 h未能苏醒大鼠共计15只；颈动脉推液后苏醒至取材时死亡49只，其中假手术组、模型组、大黄苷元组、移植组、联合组各组7、14、28 d合计死亡动物只数为1、14、11、13、10只。大鼠取材及标本固定处理未能规范操作，以及免疫组化染色过程中出现脱片、残片及背景泛染的标本剔除，其余标本纳入统计。1 T$ ~* p2 I L: F0 x( F
$ u& `5 `; U' Z 2.2大鼠脑组织微血管病理变化假手术组大鼠脑组织微血管基底膜光滑完整，分布薄厚均匀，血管内皮细胞清晰。模型组大鼠脑血管壁薄厚不均匀，微血管基底膜欠光滑，部分出现残缺、破损改变，血管内皮细胞排列不清晰，随再灌注时间延长血管结构破坏、微血管残缺不连续程度呈加重趋势。移植BMSCs 7 d后，大黄苷元组大鼠脑微血管结构改善明显，其作用随再灌注时间延长无明显变化。移植组大鼠7 d后脑微血管受损的改善作用不明显，其14 d和28 d微血管受损明显改善。联合组大鼠各时间点微血管破坏减轻。见图1。
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% n2 `! u6 u% X5 B8 A# o% U! G+ g7 _ 图1第28天大鼠脑组织微血管病理 (HE染色，200)（略）2 B0 V% _% Y- V! E& q
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Figure 1Pathological changes of brain micrangium in rats in different groups at the twentyeighth day (HE staining, 200)
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9 F: e0 w1 v5 ]8 [9 O A: Shamoperated group; B: Untreated group; C: Rhubarb aglycone group; D: Transplantation group; E: Combination group.; @6 N9 K* l; _( z; s* u4 ]3 Z- K
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2.3大鼠脑组织中IgG表达变化模型组大鼠脑组织中IgG表达较假手术组增强（P0.05）。模型组14 d和28 d脑组织中IgG表达均较其7 d增强（P
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2.4大鼠脑组织中ColⅣ表达水平变化模型组大鼠28 d脑组织中的ColⅣ表达较假手术组明显减弱（P& L" P! k; X* j2 I% M A
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2.5大鼠脑组织中MMP9活性变化假手术组大鼠脑组织中MMP9活性较弱，模型组均较假手术组增强（P
& `3 }% J, f* m. s& y: w% D9 J% `4 x5 e: F! [% G6 y9 p5 g
2.6大鼠脑组织中TIMP1表达变化假手术组大鼠脑组织中TIMP1表达明显，模型组大鼠脑组织中TIMP1表达减弱，随脑缺血再灌注时间延长呈递减趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。大黄苷元组、移植组和联合组大鼠脑组织中TIMP1表达均较模型组增强（P$ W# {5 h5 w) @% N& {, e- h0 P
6 J6 X! }& o- ` 表1各组大鼠脑组织中IgG、ColⅣ、TIMP1表达和MMP9活性（略）
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Table 1Expressions of IgG, ColⅣ, TIMP1 and activity of MMP9 in brain of rats in different groups1 n. J, z+ C1 j5 T
+ b) u; D6 v, p **P＜0.01, vs shamoperated group; △△P＜0.01, vs untreated group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01, vs rhubarb aglycone group; □P＜0.05, □□P＜0.01, vs 7 days in the same group; ■■P＜0.01, vs 14 days in the same group;☆P＜0.05, ☆☆P＜0.01, vs combination group.) o( m8 N% p! ?) `
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图2第28天大鼠脑组织IgG表达 (SABC染色，200)（略）# z3 r. h2 u- p1 \
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Figure 2Expression of IgG in brain of rats in different groups at the twentyeighth day (SABC staining, 200)' E& n6 g2 F( j. }5 B# b( U2 k9 t
+ {" o) r1 `# l# a. U$ C) s
A: Shamoperated group; B: Untreated group; C: Rhubarb aglycone group; D: Transplantation group; E: Combination group., O/ u+ T- g" C% P! D& l
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图3第28天大鼠脑组织ColⅣ表达 (SABC染色，200)（略）
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Figure 3Expression of Col Ⅳ in brain of rats in different groups at the twentyeighth day (SABC staining, 200)8 W) ]( P& g0 k
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A: Shamoperated group; B: Untreated group; C: Rhubarb aglycone group; D: Transplantation group; E: Combination group.& v: D5 D! G5 W: w x: o
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图4第28天大鼠脑组织MMP9表达 (SABC染色，200)（略）: T! c8 f/ D6 y( c2 {) W& T* O5 A
- W! _" @7 d3 R# }; \. f4 O8 R; h Figure 4Expression of MMP9 in brain of rats in different groups at the twentyeighth day (SABC staining, 200)# O- l( m" L1 F
2 A1 A# h8 i3 ]: s. M4 m* Q) M A: Shamoperated group; B: Untreated group; C: Rhubarb aglycone group; D: Transplantation group; E: Combination group.
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图5第28天大鼠脑组织TIMP1表达 (SABC染色，200)（略）
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Figure 5Expression of TIMP1 in brain of rats in different groups at the twentyeighth day (SABC staining, 200)) J: T6 v5 ^. K" |! G: O
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A: Shamoperated group; B: Untreated group; C: Rhubarb aglycone group; D: Transplantation group; E: Combination group.
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: e' f9 b4 C1 S 3讨论
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; t4 B0 Z$ g! z" }5 @% W: ^ ~ 血脑屏障对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要的意义。脑缺血可引起血脑屏障的破坏，导致脑部毛细血管通透性的增加，加重脑水肿［7］。因此，保护脑缺血后微血管基底膜的完整性具有重要意义。IgG是血清中的主要抗体，脑组织中含量微少，由于IgG的分子量较大且有血脑屏障的存在，生理条件下血液中的IgG不能通过血脑屏障进入脑组织。脑缺血再灌注损伤引起血脑屏障受损，其通透性增加，使IgG等大分子物质漏出至脑组织中［8, 9］。微血管基底膜是血脑屏障的重要组成部分，ColⅣ是其网状分子结构的主要组成物质，大鼠脑缺血再灌注血脑屏障损伤与微血管基底膜成分ColⅣ降解相关［7, 10］。本研究发现，正常脑组织的IgG较少，脑缺血再灌注损伤后，脑组织IgG明显增加，且随缺血再灌注时间的延长，IgG在脑组织中表达增加更为明显，提示血脑屏障的损伤程度随脑缺血再灌注时间的延长呈持续加重趋势。ColⅣ在脑组织的水平与IgG不同，正常脑组织的表达明显，而脑缺血再灌注损伤后其表达减弱，早期和中期随脑缺血再灌注时间的延长呈递减趋势，表明微血管基底膜的完整性受损程度在早期和中期随脑缺血再灌注时间的延长而持续加重，其变化趋势与刘轲等［11］的报道相似，但出现高表达的时间较其延后，考虑与脑缺血再灌注时间的不同有关。前期的研究证明，大黄苷元具有明显的抗脑缺血损伤作用［4］，但保护脑缺血后微血管损伤是否为其作用途径之一尚未见报道。本研究发现，大黄苷元可明显减轻脑缺血再灌注损伤后血脑屏障通透性，以早期的作用尤为明显，该作用可能与减少微血管基底膜ColⅣ的降解有关。BMSCs能够合成细胞外基质，包括Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白，层黏连蛋白和基底膜层黏蛋白等，以修复受损的脑微血管［1114］。本研究结果显示，BMSCs移植后可减轻ColⅣ降解，降低血管通透性，对血脑屏障具有保护作用，其降低血脑屏障通透性和减轻微血管基底膜损伤的作用随移植脑内时间的延长有增强趋势。大黄苷元减轻微血管基底膜胶原降解、降低血脑屏障通透性的效果明显，尤以早期（7 d）和中期（14 d）的作用显著。大黄苷元可使BMSCs移植后不同时期微血管基底膜ColⅣ降解均有减少，进而减轻血脑屏障的通透性，对BMSCs移植脑内保护血脑屏障具有促进作用。
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引起血脑屏障损伤的机制较多，其中酶对毛细血管基底膜的降解是其主要机制之一。明胶酶（MMP2与MMP9）是MMPs类的一种，脑缺血可激活MMP9和MMP2，消化降解间质内的多种细胞外基质成分，导致血脑屏障损伤，其中MMP9是血管源性水肿和继发性脑损伤的关键因素［15］。TIMP是MMPs的天然特异性抑制剂，在脑缺血病变中TIMPs的作用主要是与MMPs特异性结合，其中TIMP1可选择性抑制MMP9，阻断MMP9对细胞外基质的降解。脑缺血再灌注损伤可激活MMP9，引起MMP9和TIMP1失衡，造成血脑屏障受损。因此，通过调节脑缺血损伤后明胶酶系统失衡可发挥血脑屏障保护作用。本研究资料显示，脑缺血再灌注损伤后MMP9表达增强明显，且随脑缺血再灌注时间的延长呈递增变化；BMSCs移植后早期的作用不明显，但中期和后期可明显减弱脑组织MMP9、增强TIMP1表达；大黄苷元使得BMSCs移植脑内早期的TIMP1表达显著增强，认为大黄苷元可能是通过上调BMSCs移植后期TIMP1水平以调节基质金属蛋白酶失衡，进而减轻微血管基底膜胶原降解以发挥对血脑屏障保护的促进作用。
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