请教一个连接反应的问题

mckf111

回复 chochochocho 的帖子
) x  z# t2 B2 g3 @9 z$ o, m$ q
" T" L8 U. k/ |7 @6 o1 `结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。
# |3 }0 B. L: S那如何浓缩DNA呢 洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱 那如何对洗脱下来的DNA浓缩？8 C. r4 {, X! B! o7 x
MQ我们轻易不给用 穷。。。

ligangcw

连接了，跑电泳没了！看看两个片段的大小，是不是链接后太大没跑出来？做几遍了？若一遍的话，再试试，看看实验重复性！转了没长出来，感受态没问题，看来问题还在质粒上，感受态(可以试试碧云天的超级感受态制备试剂高效方便）

mckf111

回复 ligangcw 的帖子$ p* D8 O  q  O7 B. o/ ]; G

/ P; M& N3 U2 O8 N2 F+ h, n1 R9 H不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp
- v( t0 z5 r7 y! g& D$ Z重复了三次 还是这样 我等下传张图上来

mckf111

2011-1-16 10:15 上传

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/ F! P8 l2 o) h- s
第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
/ V3 q0 ~( C: D! b第三泳道是质粒+288bp目的片段
& @0 d. _# t- {第四泳道是质粒+570bp目的片段
: i  s/ q& ?9 g+ [" S质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。
1 x/ O1 k$ p& ?这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。
/ J  p! {' u2 dP.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

scl6682005

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul
. ]8 c, O# v" P1 |! y1 L7 x: P; e6 A$ m2 ]  I
不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。
. B. J9 m$ A2 |/ `以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。

chochochocho

) [6 h& g) J0 K) j
* N2 }6 e5 N" H7 b4 S回复 mckf111 的帖子
% f% M: `% m2 H7 b) H5 ^* `5 ]  t- {/ X, [* Z+ M; v
1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。2 ~  ~% N& L3 [/ }0 n& G) \: B2 g
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid269345) P7 E, H* A- |9 j8 q/ A4 @& Y! G: F# W
2，MQ和dDW不是问题，不用在意。
, Z! Z/ D$ m, M( s8 `  z3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选
4 m9 E0 Y$ ^& U2 c8 M4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。7 L) n! Z( H* f2 Y  V4 T

chochochocho

2 a+ {# t6 U: y1 H7 n" a+ `% r
! X& a' g$ c5 _+ Q" m; Q回复 scl6682005 的帖子, }; H3 V) F) W! e2 B% J
2 ]; v( X( V8 ^
个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。
0 f) }* X% r0 i2 R* V6 |$ B$ ?

绿雪

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。

老虎菜998

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。

ligangcw

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制