请教一个连接反应的问题

mckf111

回复 chochochocho 的帖子0 ~$ h& ]2 C. t- N

7 p0 J8 ]9 ]$ S结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。
" L+ u7 @! B( P3 |: G! s那如何浓缩DNA呢 洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱 那如何对洗脱下来的DNA浓缩？
  s( m( q2 O+ c7 L3 ?+ }! ^* aMQ我们轻易不给用 穷。。。

ligangcw

连接了，跑电泳没了！看看两个片段的大小，是不是链接后太大没跑出来？做几遍了？若一遍的话，再试试，看看实验重复性！转了没长出来，感受态没问题，看来问题还在质粒上，感受态(可以试试碧云天的超级感受态制备试剂高效方便）

mckf111

回复 ligangcw 的帖子8 U9 ~( }0 q" E+ N3 k

/ {% h. J& y. g  R不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp3 T9 B+ W* A2 h' a1 [* k  j; T9 Z; _
重复了三次 还是这样 我等下传张图上来

mckf111

2011-1-16 10:15 上传

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& g$ q* K2 x/ ]( D, i
第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
  X9 x. c  C% L$ f3 w第三泳道是质粒+288bp目的片段
" u9 A1 {; F* b7 r第四泳道是质粒+570bp目的片段
8 b' V" Q. i4 ~) N6 x- ~5 `$ m质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。; Y. n# S9 V8 c
这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。5 ^( n% }( ~$ S
P.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

scl6682005

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul
; a* J: w) f6 g1 W# e5 m9 l9 S) O% |: q5 Z% m1 s9 F! B# G& D+ B! v
不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。5 D( l" n8 d7 C" X/ t( P
以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。

chochochocho

0 I, O& Y, }: x: E
! H, W7 d3 c" r# I回复 mckf111 的帖子" c! K$ V1 j# V- O% `: h

# l; D, f" z& q1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。
5 O4 ]+ r5 T3 j7 dhttp://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid269345
$ u) i& U2 i/ c( ]8 q' V2，MQ和dDW不是问题，不用在意。& t/ M* a: Q, z6 A' X
3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选( O$ Z0 u$ F2 T! P7 O. N& P& t- h: q
4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。  q8 e7 |0 `" N1 e2 i9 o- c) Y) ]

chochochocho

! a" ?# E/ Y1 C2 L

0 f# V  e" e% R: O回复 scl6682005 的帖子
# v3 s, c8 b$ C" i& c& n: J) w& s; Y" n: [- e" a& c
个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。$ B  a! R4 n$ @* Y

绿雪

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。

老虎菜998

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。

ligangcw

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制