求助双酶切的问题

hndxws

这种情况，首先要查一下两个酶在一块以是否可以切开。以fermentas的为例。EcoRI酶切时一个保护碱基切割效率就很高，而SpeI也可以在一个保护碱基的情况下有很高的切割效率，所以同时酶切是可以的。如果SpeI需要多个保护碱基才有高的切割效率，就要先用SpeI，因为如果EcoRI切割后保护碱基就没了，在进行SpeI酶切就无法进行了。你的这种情况是可以同时酶切的，不用分分步酶切。

jun8013

两个酶切位点很近的的话，还是建议分步酶切吧，还有用Ecor I酶切完后，最好重新配个体系，也就是最好纯化下，然后再加buffer 酶等

军医

回复 lifescience1 的帖子0 y! z( w: ^" V) }+ r4 i: ]1 z

$ N. @8 x' }8 D8 E# w我都切了块10几个小时了，两个酶切位点直接挨着，一个碱基都没有间隔。

ljzmy82

回复 军医 的帖子4 Y2 l4 W6 |. q/ {
9 u5 V8 `# w  V
那双酶切三个小时就够了，怎么需要那么久呢，酶切不是越久越好的呀，是不是你的酶被污染了，还是有其他问题，找个质粒有这两个位点的切一切，验证一下酶: {6 ~. K6 s1 T' |6 ~, ~

军医

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. T" H' z# a+ S( E9 n6 W
* w+ r9 i0 h  K# [$ C  p谢谢你的解释，我已经送去测序去了，看看测序结果，我下一步还要插入一个片段，也用酶切位点相邻的两个酶切，这两个酶分别是MluⅠXhoⅠ,看保护碱基的那个表这两个酶在有一个保护碱基的情况下切割效率均为0, 这样应该怎么办呢？

军医

回复 ljzmy82 的帖子4 ~3 d- C9 c, N% z% N6 E- G" |9 e* H1 d

1 r) C! \; P; \' ^% r$ S酶没有问题，切其他的都好着呢

军医

! i2 Q/ e! \/ Q1 B7 H

* k1 O! P  `# x! {; b回复 jun8013 的帖子
# q4 ]4 I# N% J) I( d$ l1 _. T, N$ B. U) z+ ?2 o" q9 E
为什么要必须去磷酸化呢

hndxws

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6 I$ G, x( s( f2 z- `  }6 _, d7 Z
$ |+ @2 u2 O, p4 ^% G  \0 R% _" J这两个酶在一个保护碱基的情况下，切割效率都不是很高的。还是以fermentas为例吧，因为我主要用的是这个牌子的。XhoI在有一个保护碱基的情况下，效率更低。所以如果真要切的话，先用XhoI切，切好后再用MluI切。XhoI切完之后，还会残留一个碱基对，加上你原来隔的一个，MluI就有两个保护碱基，这样会好点。如果颠倒顺序，我觉得效率会很差的。$ ?2 q( q8 `6 L
我觉得分子实验不要这样设计，会影响实验效率的。

hndxws

还差一句，切的时候，虽说是分布切，但中间可以不回收的，只是再加另一种酶就行

军医

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8 B7 i' G4 q) D* y* z5 k4 }1 z# F, W* r8 o
这两个酶切位点都是紧邻着的，设计的时候没有注意到这个问题，分步切第一个酶切后只剩一个碱基，这样效率更低吧。