ips诱导求助

lerenina

回复“ada800515 ”& ^7 @  P. ?% p( X. \
我的这套就是2006年YAMANAKA的那套，pMXS-kl4，sox2，oct4，cmyc，不带荧光标签。
" j5 r* V1 H. W! B% T! }, Q* {) o你展示的293T包装的病毒，如果是单一一种感染的话，效果应该不错。但四种一起感染，全部感染上的细胞概率可能会低很多。  ]3 `! s6 t3 b0 j6 x
直接转293T就行了吗？不用加helper或者其他什么辅助包装质粒了吗？貌似单独293T不具备合成一些病毒外膜蛋白的能力哦。

christophe

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一般的做法是构建一个pMXs-EGFP对照质粒用来看转染和感染的效率，如果GFP的感染效率有百分之七八十左右就完全没有问题了。SKOM本身不带GFP没法直观的观察，但是如果感染效率足够好的话，一般感染后一到两天就可以看到MEF细胞有明显的形变，具体说来就是伸出的触角回缩，细胞变小变圆，再过几天细胞开始形成克隆集落，ips基本上就诱导成功一半了，剩下的就是继续培养了。如果前期看不到这些形变发生，就趁早丢掉不要再养了，免得浪费培养基。

lerenina

今天第六天，刚刚分到了feeder上。分之前的被诱导的细胞已经长的很密了，看不出形态有什么变化，看来我这次感染的不好了。0 S* V3 ]- x3 p+ c8 b5 O5 q$ k
四种因子的逆转录病毒不是我自己包装的，是从北京华盛公司买的，他们只给了一个滴度，也没有任何检测的方法，感觉真的很悬啊！

inno

“一般感染后一到两天就可以看到MEF细胞有明显的形变，具体说来就是伸出的触角回缩，细胞变小变圆，再过几天细胞开始形成克隆集落，ips基本上就诱导成功一半了，剩下的就是继续培养了。如果前期看不到这些形变发生，就趁早丢掉不要再养了，免得浪费培养基。”- S/ x+ z' Z% ^! N
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从我个人实验中来看，一般很少能几天就看到细胞形成克隆集落的。短则2周以内，长则3周以上的情况都有，这个不能一概而论。因为诱导过程中涉及影响因素过多，如几因子，什么病毒体系诱导，GFP效率，不用细胞来源，不用的培养基体系（这中间包括加入的各种小分子，连FBS和KSR都会有所不同），甚至feeder的情况都有可能影响实验，等等。建议还是多参考对应的文献，从实际问题出发，找出到底是哪个环节出了问题。

inno

lerenina 发表于 2011-10-18 11:50
+ h' R% x6 M8 a- q今天第六天，刚刚分到了feeder上。分之前的被诱导的细胞已经长的很密了，看不出形态有什么变化，看来我这次 ...

+ s3 z3 o/ Q/ U% K" W) P' F6 D; ]
建议不要多高的接种密度，因为筛选的时间较长，有时候长达20多天。如果是非阳性的细胞过度生长，对形成克隆还是有很大影响的。如果是原来感染效率不高的情况下，如部分荧光强，部分弱的情况下，可以根据荧光考虑用细胞刷挂掉非阳性部分，再消化铺板。总之要尽量提高阳性细胞的接种比例。

sizhengliu

回复 juan880929 的帖子
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( g4 [) }3 Y3 E4 L3 d学习了！想问：你提到的“携带EGFP基因的病毒”是指不带因子只带EGFP的空载病毒吗？

yuyan

回复 遗云射月 的帖子7 i. S! _( n% K. {7 c! R% A0 v
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做一个平行对照，包装时同时包装一个带GFP荧光的质粒（另外的孔或dish，但是同一批细胞，质粒浓度也相同）。通过计算包装的GFP的病毒滴度，估算没有荧光的病毒滴度。