统计一下大家做电转后几天挑克隆，G418筛选

lhw7514093

genedu 发表于 2012-4-23 23:16
. i/ i+ D( P7 I2 z8 C# R: C( [那的看1.神马细胞；2.神马质粒系统；3.神马培养体系；4.电转成神马细胞... ...

' u( p7 }5 l; l4 J. z6 N2 ]genedu说的好，同样的细胞，体系，挑的时间也不同，完全看自己的情况，

genedu

回复 精神病院小萝卜 的帖子, g' f+ m$ W- d- a! P7 ?2 a& f
9 s: i/ U. [" z
只换液不传代

YYQ6301

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9 t4 Q0 f  z# H/ n/ w& c! C$ ~  |8 p3 N' p( |& M
你好，是否可以分享一下你电转的条件啊

genedu

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$ f& \& l, ]  a, C% P$ e
+ ^" q& S. d" O没问题，不过我用的是LONZA的电转仪，不同的电转仪，要求的参数也不一样的

cochongg

14天啊，，，，而且有时还筛选不出克隆团，，，，

miRNA

回复 genedu 的帖子; t6 Q: B. m3 D$ j  Z# t( L/ b8 R! _6 {
5 E9 E* x3 O7 Q1 k' p9 `$ w
"电转后第二天加G418，用药物处理5天，一周后就可以挑克隆"! g$ [# {$ |  \. s" b2 D* l! x: x
假如这样的话，那刚开始确定最佳筛选浓度的时候，是用药物处理几天呢？8 A$ V! m; g; _+ ]/ Y
不应该是处理2周，确定好最佳浓度以后，电转后再用药物处理2周吗？3 d7 U1 M; f# w* W4 z+ O& {% B$ f
7 A% I( \1 V) I& p! A0 r! J: H
谢谢！

miRNA

回复 genedu 的帖子7 W, K* a" m! Q: x

$ L) C& }0 b+ x+ p& G+ ?请问，您用电转以后，大致的筛选步骤是什么？9 n$ k( ~/ x3 L1 _1 J0 p$ x8 F
用什么方法挑选单克隆？
2 u% \- q4 h) X" ?( F  d, d另外，假如药物筛选以后，再用流式细胞仪筛选，那还用得着挑选单克隆吗？' m  U0 S+ d7 {
4 w4 H' A" l) P; B! l0 ~+ r2 N
谢谢！

genedu

回复 miRNA 的帖子9 v9 @$ o) o) C8 M) |% L

0 W; K! ?/ Y' |. b4 j$ z* F6 k不知道您需要诱导的细胞是什么细胞，首先应该确定药物筛选的浓度，就是利用您的成纤维细胞，做药物梯度，假如您想筛选7天，就看在7天后，那个药物浓度下，细胞死得比较干净，就选择那个药物浓度，具体需要几天根据您的实验设计而定
, {, @/ \, r% S6 E' V' M5 E确定好药物浓度后，电转后先需要不加药的培养基恢复培养一天，然后再用药物处理
& R8 ^9 Q! N# F* R4 g挑取克隆也是根据您的诱导的细胞而定，举个例子，假如您是诱导的小鼠iPS细胞，就把克隆球划下来，胰酶消化，吹打，中和加到培养基中即可& T( m  l9 J2 a! M' H
关于流式细胞仪筛选，我的建议是，先挑取克隆后，再用流式筛选，那样效果会更好
) [1 a8 h# Z7 |* p
8 e9 W& S. }: d( R; c5 s

miRNA

回复 genedu 的帖子! }# T( [* @4 E# `: u
( x; a; m- Q& c4 f% y& D, I- A+ D
如果按照您的说法，筛选几天都是需要实验设计而定的话，那肯定筛选时间越短越好喽，节省时间嘛，可是电转一天后，加药物处理，一般都得10-14天吧，那之前确定药物筛选浓度不也得至少10-14天吗？5 s3 b9 y8 I8 @# K( y4 U. B

) P1 J- n  T' ?3 Q, y另外问一句题外话，您知道是否有人在质粒的SV40 promoter-NeoR的后面加上IRES-EGFP吗？因为质粒本身没有带GFP，可是由于各种原因，插入的目的片段后面也加不了ires-egfp，那利用新霉素的启动子SV40来启动EGFP的表达，这样可以吗？! N8 ^; e5 s0 W. p/ z

% X6 w" e1 c9 L谢谢！

genedu

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) l( u  s$ N0 Q4 k0 ?# ~2 |) O6 `+ y  j$ f8 J' u
筛选的时间并非越少越好，时间短必须得使药物量加大，这样会使细胞遭受很大的损伤，一般的文献报道在7-14d之间，不过每个实验室也有所不同，我在筛选时偏重于药量比较大，一般5d，我感觉这已经是极限了，不能再少。
) i/ n9 z3 [0 t! e7 c1 v; r" R! E+ X* r关于SV40 promoter-NeoR-IRES-EGFP我没做过，不敢乱说