错在哪一步，望赐教！-------谈脐血分离EPC

542177563

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4 A3 k# {5 |- Q. z
. \7 d. I' k3 ]6 K7 I0 a先谢了！

zz091115

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4 y- z; f0 e; W5 T( l8 o8 l1 n2 a
纤连蛋白还是别省了 我没做过对比 但是貌似有不小影响 小鼠骨髓效果是不太好 我之前也碰到过 还有和你小鼠有关 老鼠周龄短自然才好做

542177563

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& J: T7 I, P# J. r0 x1 b2 k8 Z* |1 {
看到你培养出的EPC克隆团图片很漂亮，请问是用成人外周血分离+fibronectin涂层培养出来的吗？培养几天得到的？

almasun97184

脐血不能先用红细胞裂解液再密度梯度离心。你做的这一步是为了什么啊？Ficoll的说明书也不是这么写的啊。直接稀释了离心就行。
4 K4 @. h) [9 Q* A+ q# O脐血稀释倍数和血液Ficoll的比例不是特别重要，有点出入关系不大。1：1到1：2都可以。
5 ]6 V' F& m  H0 F离心时的加速度确实非常重要。必须为0。移动的时候也要很注意。0 Y- N- |7 K- L% U3 e) q& A2 ?
FN还是铺了好，影响不小。没有FN，出来的克隆又少又小。

realinter

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* U/ Y2 V4 x7 F$ i同求步骤啊scylc@163.com$ C) V. u4 x) r& G  {
另外，EGM-2培养基怎么使用啊，给了很多补充试剂包括EGF,FGF,VEGF ，vc，FBS什么的，是全部加进去吗，还有FBS在 kit里面只有10ml ，要另外补加到10%吗，谢谢

quit6927

542177563 发表于 2012-5-11 21:37
, B6 h/ G3 D6 l2 }; R% T% I具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白 ...

6 b& D! m, K; \$ N" K$ h9 r铺板是必须的。不知道红细胞裂解液处理会不会影响MNC活性，我们直接生理盐水稀释然后就ficoll离心。我们的经验，脐血的分离效率也是很低的，几十ml也就1、2个克隆。

evial

你太有才了，将红细胞裂解法和梯度离心法合二为一！本来外周血EPC就很少啊！洗来洗去的说不定就洗没有了，哈哈

coffee.cat105

" `. E. y9 M7 C

, P& F  |- z7 @5 W6 f) k8 x回复 穿越地平线 的帖子
5 ?3 ?# g2 K: Y6 t. ]7 e
- ~5 D% ?- R0 n) u5 I$ |能发一份给我不？我们正要开始做，想要一份详细步骤，万分感谢，

PercyLaw

另外，密度梯度离心Ficoll液：血液的比值是在离心管中高度的比，尽量两段都长一点，加血液的时候一定要慢，离心力宜小不宜大，时间长短可以自己摸索一下。而且有的朋友说，Ficoll液的厂家和质量也决定了白膜层的清晰度和分层情况。7 O5 f2 C0 _- g$ c8 |
我个人感觉还真是不需要红细胞裂解的，直接在ficoll液中加稀释的血液应该就可以。

PercyLaw

个人认为，EPC这种细胞还是比较少而且娇气的，所以洗细胞可以试试用培液（不加血请的，最普通的那种，1640也可以），对细胞的损伤会比较小。