为什么插入片段后，细菌的培养温度变化了？

weiyepan

这有可能是因为你插入的片段对细胞有毒性，37度长太快的时候细菌承受不了会死掉。

miRNA

回复 lxm5668 的帖子7 _: h/ h* R/ e7 x2 v1 H6 Q

5 ?2 S4 ?4 J* x( z4 Q1 B您可能做的是原核表达以后纯化标签蛋白，因此涉及到蛋白水平，但是我做的仅仅是转化诶，然后长单克隆而已，所以，只是核酸水平吧...

miRNA

回复 youzi821 的帖子/ K: L) }- A2 Z. O; t% Z

& {. x  ~% U/ y5 e! \& w$ X1 i3 c$ X虽然我并不知道基因是否是温度敏感，但是根据常识，应该是跟温度有关的，但是我做的仅仅是转化，转到DH5a里面，长单克隆，因此，不涉及到蛋白...

miRNA

回复 weiyepan 的帖子
0 w' x0 u; o: k8 A, y# y
" O+ a$ |/ O0 e7 |插入的片段也仅仅是核酸而已啊，转化也并不涉及到蛋白水平啊，怎么会对细胞有毒性呢？; M7 A6 t! c5 R
仅仅是转化而已...

shy8610

回复 miRNA 的帖子) q  Q; Z4 _* p
* c, Y- l9 [! E; u- X8 D
楼主能详细说明一下，你们插入什么类型的目的基因，因为我们实验插过一个慢病毒的一个包膜区，也是大片段，5k作用，需要在30度，180转才能长好，温度和转数都要低一些，我们的感受态是top10，一般转化培养条件是37毒，220转

shy8610

回复 miRNA 的帖子" ]2 X$ l0 y$ a4 K3 T

+ d7 v+ Q: k+ p3 X0 |) F楼主能详细说明一下，你们插入什么类型的目的基因，因为我们实验插过一个慢病毒的一个包膜区，也是大片段，5k作用，需要在30度，180转才能长好，温度和转数都要低一些，我们的感受态是top10，一般转化培养条件是37毒，220转

miRNA

回复 shy8610 的帖子$ W: w/ V. N7 @: o, r7 [* a% L3 r

6 F" ~  ?# A- \7 V$ M. u- j; `就是人的基因，3kb，只是最后1kb是高度重复序列...我想问一下，您说的转化，还需要转数是干嘛的，我们只是在温箱里面培养...

shy8610

回复 miRNA 的帖子
& X9 N: w- H* [
9 L) l# s" a; h$ {* d4 U( ~6 q不好意思说跳过了，转化当然不需要转数，挑克隆增殖的时候，发现温度和转数都得降，哦，有大量高度重复序列，我们那个末端是LTR区，略有不同，但都属于大片段

weiyepan

  G# v4 v- I& d; G+ Z$ ^
; l/ ?4 ?/ J6 O) y% v0 {
回复 miRNA 的帖子4 [# `! y% d! P/ s; q% O& ^

7 ^' E  j% J# X; E, v原核的启动子区很小，一般只有8个碱基左右，如果你的外源基因比较长，那内部启动的可能性也是有的。也有涉及到温度启动的原核转录因子，一旦启动了转录，你的后续编码对细菌有毒性，就会出现长不起来的现象。
, ~5 Q: x2 H2 ~. p1 ~$ L9 q: ^这种现象的解决办法一般是要把你的基因密码子优化一下，可以提高菌长的效率。