关于组蛋白乙酰化WB

mayansen1314

个人认为提取核蛋白是比较好的，我做的是组织的4型组蛋白乙酰化检测，用的是cell signaling的抗体，效果很好。

puddingwawa

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. C# k' i4 v4 o6 Q  Q9 O& g* r我的核蛋白提出来浓度总是很低，只有0.3ug/ul左右，这样对于结果会有影响吗?

PTM2013

细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法 0 g( o9 U, {( S/ o/ K! q
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步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白   E3 Y& a" T/ d  ?9 B) Z

2 x! D" Q, @! ~/ L) k1.用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm离心2分钟，取上清备用。 ( ^! S8 B8 t/ w" O
2.取20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。
3 c# e) Z) \* H* m' c% v3.将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC旋转摇床低速孵育60分钟。 % W: p' Y) t3 y3 X, U/ H
4.1000rpm离心1分钟，去上清，用PBSt重悬沉淀，1000rpm离心1分钟，去上清，重复3次，最后一次用PBS洗，吸弃上清。 5 x% ?+ T4 G* o
注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。 & T  z* [  v" X3 q/ ^4 e+ {

8 {, e/ X5 q% V1 o  Z2 c步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白                                    
$ Q8 B8 D6 f$ p8 a! d" X+ j! X5.用20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟，10000rpm离心1分钟，将上清液体全部转移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分钟；
- m$ r, E; a" V. O6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封闭10分钟。 1 u/ G6 L: l3 i9 Y3 {+ s

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步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平 3 h( B* |& B* W6 `, a$ Q+ K6 W; j
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7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分钟。
. ]( @+ m9 c6 Q- _" Q" {2 W0 E: ]8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4终止反应，在450nm波长下读数。
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sylar.wy

cell signaling的抗体还可以吧。好像酸提会影响乙酰化的。。