MEF原代 第一次传代

wawj

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我做的是昆明小鼠的孕鼠，孕13-14天。可能有些人是用ＣＦ－１小鼠，但方法都一样。下面是我的操作步骤，每次分的都挺好，分享一下。& K% R* G4 \$ P+ F
１.颈椎脱臼处死孕鼠，立即放在预先准备好的７５％酒精里，浸泡大概五分钟。（一般就是从动物房拿到细胞室的时间，下一层楼。浸泡时间不能过长。）
2 U; `2 V  B8 w- D: H( V２.以下过程在超净台里操作。将孕鼠放在一无菌培养皿中，腹部朝上，剪开腹部皮肤，剪一个小口，然后用手撕开，充分暴露术野。  F0 U# Y4 Z7 L7 O  a
3. 用棉球擦一下剪子，酒精灯烧一下，进行下面操作。剪开腹膜，提起子宫，剪断子宫系膜。将子宫放入另一培养皿，滴少许PBS（做原代时ＰＢＳ不需要预热，温度较低对分离细胞有好处）然后进行钝性分离。用两把镊子，将胚胎一个一个拿出来（去除了胎盘胎膜），放到另一培养皿，进行去头，去尾，去四肢，去内脏操作，余下的躯干部分放到另一培养皿，用剪刀充分剪碎后吸到10ml离心管里。
5 v" {. D+ B: P5 {& X: {1 H" N4.用PBS洗一到两次，然后进行消化，10ml离心管大概加0.25%胰酶1ml,再用ＰＢＳ稀释３－４倍。震荡消化，时间最长不超过5分钟。一般我到3分钟的时候就剩一些絮状物了，基本没细胞了，就立即终止消化，用200目筛网过滤，收集滤液于离心管中，800r/min,5min,弃掉上清，用新鲜培养液重悬，接种到预先铺有明胶的T75瓶中（这样有助于贴壁）。一般两个胚胎种一大瓶。我一般一次能种六瓶。
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lchoxy

看看这个protocol
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lxm5668

你的PBS或者胰酶有污染的可能。怎么会好好的一下子连冻存的都污染了呢。6 u$ |% l. ^$ p: c' ^
养细胞建议要分批次做。传细胞时密度不要传的一样，有密有稀，这样下一次传代就能分开了，所以有问题时也不至于全军覆没。

lxm5668

盛夏季节特别容易细菌污染，防不胜防。细胞间彻底消毒一次，该休假休假，错过这段点背的阶段。

wawj

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, z/ D4 O) @: g& z, i
2 g) I  j) u: V5 V3 W0 W恩，谢谢，冻存的的污没污染我还不确定，复苏了再看看，你这个建议不错，谢谢指导。

wawj

复苏了一管冻存的细胞，没有污染。谢天谢地，冒险用原来的培养液养的。证明培养液没有污染，ＰＢＳ，胰酶也都是好着的。至于它为什么污染了呢，现在看来可能是以下两个原因：; V1 l& V: u! r
１.当时瓶子没有完全烤干，还有点湿，污染会不会来自那里。
7 U, E# C- H9 w4 H+ D２.为了节省明胶，用过一次的明胶回收，下次再用一次再弃掉。当时铺的明胶是回收的明胶，以前都好好的，这次就出问题了。看来以后不能明胶回收了。

pjlsyz

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" J9 o1 G8 C. s9 N$ h$ @6 i3 [# o% ]$ f( _& L- e
我晕。。。你这东西解压不了。。。

huangcong1988

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  m2 w# q. C  K4 R6 |7 N跟你分MEF的方法很类似，但是我遇到的问题跟你不一样，我是冻存以后MEF状态就不行了，要么复苏不贴壁，贴壁的传两代就污染。这个问题遇到很多次了，分MEF的时候状态很好，而且我一般是一天不到就能完全贴壁，满瓶(T75).今天分，第二天早上就可以冻存了，但是冻存后复苏就怎么都不贴壁。之前我发帖里面有我细胞的图片http://www.stemcell8.cn/thread-58210-1-1.html