MEF用丝裂霉素C处理第二天就崩盘

刘森泉

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* t* w2 @2 X. G9 D1 \. X$ p% K, G% Z- J+ X) D6 x/ x  M
用PBS能完全溶解吗？我的用水溶，还有小片状么。

huangcong1988

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! p; E) b5 D* F9 g+ c* S' t
我养mef，传两代就污染了，细胞里面全部都是沙子样小黑点，怎么回事呢？分的时候还是很好啊

刘森泉

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1 f: e( O/ H  \* A  T9 a+ ~污染得原因多种多样，不能确定，能做的就是把PBS，胰酶，培养基全部换掉，重新复苏细胞试试。

huangcong1988

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# C# X" v* Q# Z0 @
5 [- a8 h0 J% D: x9 L- K* v还有就是我分了MEF之后冻存，结果怎么复苏也复苏不起来怎么回事呢？程序冻存盒，冻存液也很好

刘森泉

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! U8 [- {) R/ T5 g6 N, a2 R" Y' q% W
用同样的方法冻存下293T这些较好养的细胞，证明冻存方法OK的情况下只能看你的细胞状态了。

wbj1983

1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
; W7 @. m& z5 Z  `2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。
. K" _6 H% L: y( ~2 ?' j3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。
/ K+ u+ d+ c0 G" L& b1 |4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！. U2 S% T- t, @. H8 {* L) E
5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。, C& k! G+ K$ V+ l: i  b/ v
这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

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! H1 ~/ r7 A  j. X0 I% s. G0 o1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
+ J& j( _! T! @: O  v2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。
2 L8 x/ }7 _. Y1 o* O0 }8 r3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。
1 K* G0 _& q0 w+ T4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！
6 ^* r4 b. s% E" L& \# c5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。8 K: ]4 S& y- X9 C
这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

上面的丝裂霉素C是：sigma-M0503-2mg的/ B  z9 W* k& a
打字的时候打错了，非常抱歉！

bibottll

我才做过的，细胞长得很好啊，5微克/微升，PBS溶解，处理三个小时后用PBS冲洗5-6次

开心果王

我一直用的是海正的，没有发现细胞全死掉了的现象，我们一般处理后就消化计数并冻存起来了，并没有继续培养，只是在复苏后会发现有死细胞漂浮，但贴壁的细胞还不错啊！我是用PBS配的，不知道楼主是否某个环节出现了失误还是什么其他的原因，可以将自己觉得疑惑的地方跟大家分享一下。