MEF用丝裂霉素C处理第二天就崩盘

刘森泉

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: ~2 m6 \4 x3 z' M5 f6 ^. ~4 G9 s; p: c2 m, Y& m6 k! y
用PBS能完全溶解吗？我的用水溶，还有小片状么。

huangcong1988

回复 刘森泉 的帖子. S! c2 o! @. z- f- c  y0 D4 u
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我养mef，传两代就污染了，细胞里面全部都是沙子样小黑点，怎么回事呢？分的时候还是很好啊

刘森泉

回复 huangcong1988 的帖子1 s, n0 N, F+ H, d5 G

7 J7 L/ l6 y5 E( z0 p+ f污染得原因多种多样，不能确定，能做的就是把PBS，胰酶，培养基全部换掉，重新复苏细胞试试。

huangcong1988

回复 刘森泉 的帖子% c; l' t4 Q& z) ~

; ]; @$ b6 U( N$ f还有就是我分了MEF之后冻存，结果怎么复苏也复苏不起来怎么回事呢？程序冻存盒，冻存液也很好

刘森泉

回复 huangcong1988 的帖子1 L8 W0 S% \6 `- O2 p7 s5 W6 W4 W% ~
& r1 x* S; `) E3 m2 ~* ]1 Z+ e
用同样的方法冻存下293T这些较好养的细胞，证明冻存方法OK的情况下只能看你的细胞状态了。

wbj1983

1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。8 l3 x5 H( r$ m- @2 r. s1 S" X
2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。; V( Z& A' M' W
3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。9 X! [# t0 x: O7 v
4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！( O0 ~! U  M6 m. q
5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。9 h" n9 z! R2 r
这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

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1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
( B: P" V; |4 D2 ^% C2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。( r* k4 E9 O- h* j& V4 q, K% |
3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。$ o7 u* b  [" p  ?
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5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。
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wbj1983

上面的丝裂霉素C是：sigma-M0503-2mg的
5 w  b5 L. h; Z" ]( e6 X5 h打字的时候打错了，非常抱歉！

bibottll

我才做过的，细胞长得很好啊，5微克/微升，PBS溶解，处理三个小时后用PBS冲洗5-6次

开心果王

我一直用的是海正的，没有发现细胞全死掉了的现象，我们一般处理后就消化计数并冻存起来了，并没有继续培养，只是在复苏后会发现有死细胞漂浮，但贴壁的细胞还不错啊！我是用PBS配的，不知道楼主是否某个环节出现了失误还是什么其他的原因，可以将自己觉得疑惑的地方跟大家分享一下。