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引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：
) a+ q+ [6 J8 _. W) V$ [! g0 x+ v x1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 - z1 H2 }5 U* ^+ i
2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
" @' i: a# `) a4 c. k3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
; n6 g& S1 K* M3 _4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
H/ u- W) g( i) x$ @! j, O/ ~5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
9 s `7 d: d. Z+ _6 ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
" a. l; Z, v9 N7 } O7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
" F; p& Q9 l( L _$ u& L8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
B& C n$ ~* ? 9 两个引物的Tm不能相差5度以上
$ f, c2 E) d" l* V3 g 10 荧光定量引物的产物最好在200bp以内 |
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发表于 2012-9-6 16:12
