求助引物，谢谢了

cjsbaicai

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：
5 B- v% r3 O- K+ `3 c+ h$ n7 f# t1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
: X* _' [6 p  L: d2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 0 F) M1 _8 S/ y/ T& v
3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 ) s( _' ]( Z- S- f3 {  p  W! ^. N
4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 0 ]' Q% G9 {  o$ M3 V* o
5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
# j0 P0 h8 }0 b$ L0 v# P  s+ Z6  ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
6 J6 n: O5 `6 ]9 W5 m0 q7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。 3 g% J% X' J$ i$ e
8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
: ^! a2 K" p5 S7 Q# s: |0 E8 S   9 两个引物的Tm不能相差5度以上0 U5 W( V+ x6 x- |  R* \# R
   10 荧光定量引物的产物最好在200bp以内

zhaonicholas

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8 g, n$ I" j/ [( }* r4 w+ u. C% U. [! I+ t' t8 R8 q
谢谢

weiyepan

! [: C1 I5 n! m1 A7 n
" G* M- S5 e  W, }4 K回复 cjsbaicai 的帖子! L0 l1 Y: n. ^" \( j6 j( P
* E7 u# @  F' H' I" M& B
你这段那里抄的，错漏百出，别误导人。举几个例子：
3 [# g* g- T! b# V4 j7 \. M" m& v1. “引物......过长会导致其延伸温度大于74℃"——没听说过引物会影响Taq酶的反应温度的，延伸温度是根据酶的最佳反应温度调整的；, U) g! @5 V3 A
2. "3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加"——我们做了几万个基因没有过这样的经历，请注明文章出处；) ~  @3 ~" y0 y' Y: |: t
3. “引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳"——引物的Tm和对应模板位置序列的Tm有不一样么？4 g6 g. s/ H4 K/ J0 g! E3 m, j
4. ”∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能"——这简直是是非颠倒了，∆G是指DNA 双链形成释放的自由能，反之就是打开双链所需要的能量。∆G绝对值越高，结构越稳定。
. H1 N8 I: @" b/ a$ M, D上面说的都是最基本的理解问题，其它的若是若非的技术问题我就不说了。

safflower

你进入idtdna.com主页后点击Scitools下拉菜单的Primerquest，具体来说是这个网址：http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/" n  J( s6 k' v4 |
在sequence中将你在pubmed中查到的目地基因的CDS序列copy进去，选择realtimePCR和PCR primers，点击calculate就出现五对引物了。5 |2 A+ ^- I( v  N* l! |/ F

6 e0 D$ ?( Q: m5 q7 R+ b0 W# t至于你说的突变体，是不是指的转录本呢，有些转录本是没有产物的，至于那些有产物的转录本，你可以将它们的CDS序列比对一下，选择共有的序列去设计引物。
! x8 n, ]1 A( T) q; @# J

zhaonicholas

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; a/ C0 n* ?/ |1 x7 f4 M7 |) \3 b
, j) |' q/ v" \# Y非常地谢谢你 我现在就去试试看。

zhaonicholas

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5 r0 K) d9 B. L- e  X  C4 A0 v* `* m/ A5 x
恩 引物是设计出来了哈 但是在primer 5里面看 引物的cross dimer的”∆G 值“太大了 几条引物都是40左右。不知道这个是否可以解决啊
* }7 A7 d1 d5 Q9 f3 K- }& cGFAP的引物

safflower

设计时不是出现几对引物吗？基本上都可以试试，最好先选择我昨天跟你讲的引物，其他的因素影响毕竟不是太大。

xyybetter

使用primer 5设计引物。引物的Tm值最好在58～62度之间，GC含量在40%～60%之间且两条引物GC含量接近，引物长度在21～25bp。满足这些条件的引物适宜用来荧光定量PCR。在程序跑完之后要看一下熔解曲线，有单一峰的说明是非特异性扩增。

86964109

xyybetter 发表于 2012-9-14 15:46 4 v4 p' U& s3 @- b) b. |
使用primer 5设计引物。引物的Tm值最好在58～62度之间，GC含量在40%～60%之间且两条引物GC含量接近，引物长 ...

) E% H3 x: Y. Y6 {& N1 ]“有单一峰的说明是非特异性扩增”，说明没有非特异性扩增吧？

xyybetter

回复 86964109 的帖子1 i/ z6 T/ E" E! I
* ?7 D: G0 k( J
是的，有单一峰说明没有非特异扩增。