脐血间充质培养第十天

zhangjieyctc

这个估计是造血干细胞吧，没有间充质干细胞的形态

小公

我养的也是大量的红细胞形成，而且分离液分离的白膜层也不明显，求助啊

fengxiwu

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/ }4 c: w+ X) z" L     我用的是白血病病人骨髓单个核细胞，因为是白血病病人，有时分离的单个核细胞量特别大，可以达到10的8次方的量，此时离心管中的单个核细胞层就像是一个硬币——实心环。洗涤后的细胞沉淀量大概在0.3-0.5ml，很是惊人。当然，也有的仅仅分离出5×10的6次方细胞的时候，洗涤后的细胞层几乎看不见，也经常有混杂红细胞的情况——可能是分离液温度及离心设备的影响或其他情况。
* x  }) Q& i+ [) o5 q2 U    分离的细胞多了，间质干其实也是相应绝对数量是增加的。养的时间长，样本多，遇到很多种不好解释的情况。先前回帖中提到的内皮祖细胞呈线性生长，遇到的时候感觉这细胞很是神奇，竟然长成这样，一大奇观。单个核细胞的培养密度太大的话，确实影响间质干的贴壁，但是或许不影响间质干的增殖。再降低密度换瓶或皿培养后，贴壁细胞明显是多与原代的。: L% i/ \! E7 k+ a
    淋巴细胞分离液对间质干的贴壁时间的影响是显而易见的，我通常是第三天换液，将悬浮细胞存在的旧培养液上清缓缓移去，添加新鲜完全培养基。其实常用的各种基础培养基都可以支持间质干的生长，不知从什么时候大家都习惯用低糖DMEM.! I! U; R3 L* v, T2 i; z7 }
       间质干的生长是很有意思的，刚开始是圆形，同悬浮造血细胞的大小差别并不是很大，但是慢慢的爬伸、长大，竟然可以达到150微米的长度，它的细胞核都赶得上悬浮造血细胞的大小。
2 a) @, i# h7 a; b& N+ j* \    一直找不到很详细的想要的那种对间质干的描述的著作或者文章，比如，生长的密度，细胞大小，电镜特点等等。虽然有很多著作是关于间质干的。
* g6 Y0 u- f5 w; h$ {     我在六孔培养板中培养的间质干，在80%融合度时，每孔消化测定的细胞密度是10的5次方，也就是相当于每平方厘米一万间质干细胞。不知有多少战友曾经测算过，密度是多少？

小公

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谢谢，我刚开始培养，离心2000转，30min，温度没有设定，水平转子离心机，白膜层几乎看不到，只是2层，上层血清，下层红细胞沉淀。请问你用的哪一种淋巴细胞分离液啊？

小公

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对啊，红细胞成片存在，没有一点间充质的样子，我也是直接用淋巴细胞分离液分的，是否是先用羟乙基淀粉沉降下红细胞再分离效果好些，你现在养的怎么样了？求指导

fengxiwu

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谢谢，我刚开始培养，离心2000转，30min，温度没有设定，水平转子离心机，白膜层几乎看不到，只是2层，上层血清，下层红细胞沉淀。请问你用的哪一种淋巴细胞分离液啊？

5 d0 ^6 }- `/ n% g$ M我用的是——*****生物制品科技有限责任公司的人淋巴细胞分离液。操作要轻柔，淋巴细胞分离液不能和稀释的骨髓液或者血液混杂：分离液在下，稀释液在上。照说明书上的操作就是了，梯度离心用的就是水平离心机。一次不成功，不要紧，总结经验教训，找出原因，希望下次顺利。

fengxiwu

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& d9 g+ o. S6 V8 O. G( }回复 小公 的帖子
3 y7 v1 Q/ C# ~# Z2 n
9 S- ~) a" I) y我用的是——*****生物制品科技有限责任公司的人淋巴细胞分离液。操作要轻柔，淋巴细胞分离液不能和稀释的骨髓液或者血液混杂：分离液在下，稀释液在上。照说明书上的操作就是了，梯度离心用的就是水平离心机。一次不成功，不要紧，总结经验教训，找出原因，希望下次顺利。

henryjia

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2 d( y( z( d4 m# h/ m( d( ^3 g$ D- W4 k" Y7 z
您养过脐带MSC吗？好用吗？我是指分化潜能。脐带MSC我试过好像不行。

小公

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嗯，谢谢，我也买了TBD天津的淋巴细胞分离液，我想问下，是直接分离，还是先羟乙基淀粉沉降下红细胞，另外，我取脐带血是80ml，加上PBS混合1比1就是160ml。需要分离液很多，需要先离心下血样，去除血浆吗？谢谢了

fengxiwu

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5 n2 r1 S7 _' `, }+ _
你这个情况，说明书上应该有说明的，血液量太大了，自然要提前处理一下，减少体积。这么多的脐血，单是红细胞的量就能够达到几十毫升了。离心去除血浆是必需的步骤，然后PBS重悬，你梯度离心用的应该是50ml的离心管吧，分数管才能一次做下来。