脂肪干细胞分离不出来

匡大鹏

大家好，最近在分脂肪干细胞，好几个月了，一直达不到预想中中的那样：附睾处脂肪（5只小鼠），取下后置培养皿中PBS洗2-3遍，眼科剪充分剪碎,加入4倍体积的I型胶原酶溶液（浓度1mg/ml），转移至50ml离心管，振荡器振荡，37℃，30min,振荡后加入等量培养基（DMEM+10%FBS）终止消化，60目筛网过滤，后再用100um细胞滤器过滤，1000rpm,5min.用HBSS洗三遍，加入红细胞裂解液室温5min,再1000rpm,5min。得沉淀加培养基接种到6mm直径的培养皿，至温箱中培养1小时后，吸出培养液至另一培养皿，继续培养至24小时换液，以后2-3天换液体。
- h& M- q! h5 s% N问题：1.各位师兄师姐你们是怎么把得到的脂肪干细胞细胞沉淀中的成纤维细胞等杂质细胞去除的呢？我用的是差速贴壁法（见上），不知道这一步大家是怎么做的？还是根本就不需要？每次昨晚这一步之后细胞就很少了，贴壁的细胞就更少了，哎。/ q& ^+ T. R0 D- W/ M4 @0 i
       2.细胞一直是圆形的，都第10天了， 基本上没有出现形态学的变化，文献上说48小时开始贴壁，后面会细胞出现梭形变化，可是我做的一直没有想象中的梭形形状 出现啊?; s8 Q" \. V$ e% K0 Y' w1 ]' N
            3.按照我上面提到的条件，振荡消化完之后离心管上层会出现白色层，不知道是不是成熟的脂肪细胞？是不是代表没消化完全还是？
- D5 G, Y6 ^" m4 C  J3 F衷心感谢！！！！！！！！！！

s02260441

可以试着延长下胶原脢的作用时间，延长至1小时试试吧！$ P3 m7 d7 _. E3 c; e
应该可以收到更多的ADSC。
% \+ m* {- k% c. F; p- r' T# y2 H* F/ |$ k; s- I% E
建议培养中加入些Growth factors，刺激ADSC生长。

zfgxb

我提取的脂肪干细胞培养后及传代3次后也一直是圆圆的亮亮的，不知究竟是脂肪细胞还是脂肪干细胞，但我提取的时候观察了一下，离心后分为3层，据文献上说，最上层黄色的还漂浮着一颗颗油分子的是脂肪细胞。着白色的应该是脂肪干细胞。但也有白色脂肪细胞。

shangguan6471

大家都是用什么鉴定指标呢？

细胞海洋

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luyue6453

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$ Y$ X! a  U6 S$ }& B. W7 {* I( @5 N" @: z( {. b7 p' E9 Z
你不要裂解，裂解后使细胞很脆。

shangguan6471

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# Q' ?* y- {& U
" J6 A( _, ]; K& ?/ \/ `4 i好的，非常感谢

wf78365421

1、不用裂解。  2、不用差速贴壁。

小云龙

鉴定可以参考间充质干细胞的，如果不怕麻烦的话可以用Dispase分散酶（资金充裕的话）

白白大柚子

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1 Q* _8 H( w3 W$ o2 x. T
0 {/ M" }- _. \6 f流式，CD29,CD44