神经干细胞的原代培养与传代培养

zb_ming

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再来回答您第二个问题：“我冻存了部分细胞昨天复苏，今天观察了细胞状态，发现细胞大量都死亡，可见一些细胞团存在，但感觉很单薄，状态不好，轮廓不清晰。。。”。这个复苏细胞第二天大量死亡大部分情况下属于正常现象，3、4天的时候能恢复增殖再次形成细胞球，就说明你的细胞还不错，如果继续死亡的话可能有两点值得注意：一、冻存时细胞不是在绝对生长期，也就是增殖能力最旺盛的时期，这样的话细胞活力强复苏效果好。二、您回顾一下复苏过程有没有出差错，因为这个过程对细胞损伤也比较大。

zb_ming

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第三个问题：“之前一直养的一些神经球也总是第3或者4代以后状态就越来越差，生长很慢，而且不断死亡，”。这说明你的细胞状态确实不是很好啊。一、首先排除外在因素如：培养液符合要求不？生长因子浓度及质量有问题不？是否用胰酶消化？浓度？时间？等等有问题没。当然这几个问题一般不容易出现，但要排除。二、接着就是取材问题：取材部位（我后来直接取皮层，方便 量大）；取材后是否洗干净？脑膜是否剥离干净？吹打细胞力度是否适当（这个靠自己摸索，没有客观标准可以参考）？细胞接种密度？这个很关键的，一定要摸索好条件，不行就计数细胞，熟练后可以不计数，毕竟计数这东西本身就值得怀疑其准确性，十个人会有是个结果。三、就是培养过程了，相信楼主养一年多了应该这个问题不大，但要严格操作过程。

zb_ming

回复 七色花 的帖子5 M0 H2 I0 h* x# R0 z
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最后楼主“养神经干细胞都一年了多了，总是堵在养细胞这块，没有细胞其他实验也无法下手，”。这个确实挺愁人的。以上问题解决后再不行建议楼主到细胞养的好的实验室去观摩一段时间，看看整个流程跟自己有什么出入。这个比较见效。愿楼主早日走出困境！

zb_ming

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2 C5 S8 P6 q& `. R3 W- R最后楼主“养神经干细胞都一年了多了，总是堵在养细胞这块，没有细胞其他实验也无法下手，”。这个确实挺愁人的。以上问题解决后再不行建议楼主到细胞养的好的实验室去观摩一段时间，看看整个流程跟自己有什么出入。这个比较见效。愿楼主早日走出困境！

zb_ming

七色花 发表于 2013-11-6 10:59 % E' K' q+ r& q+ Q$ M" a
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, _* S) {9 z  T' t- V这是神经球突然全部贴壁后生长状态图片之一。

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这张图很明显是铁壁分化了。而且可以看出你的细胞密度不大，或者已经死了大部分。分化的细胞大部分是星形胶质细胞，还几个少突胶质细胞。

pengxuleo

看你的实验，可能有两个方面注意一下：（1）培养基，可以选择invitrogen的神经干的培养基或者添加物，还是不错的，我自己用过的，神经干可以长到第7-8代的样子，后面我就没再继续养了。（2）冻存液和方法，冻存液如果自己准备的话， 血清可以提高些，如果有条件，可以买商用的冻存液；方法，我个人觉得，神经球打散后冻存的话，存活率会高些。

七色花

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谢谢楼主，我冻存液买的是GIBIco的，应该没问题。只是细胞细胞复苏后存活不多，而且生长缓慢呀，不知道是怎么回事？？？

七色花

回复 zb_ming 的帖子% [3 `. N' W& ?  w0 v) c, P" \
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非常感谢楼主详细而又专业的分析！我复苏的细胞大部分死亡，细胞里面的杂物超级多，离心后还是没什么改变。不过第4天后有少部分细胞存活下来，而且形成了神经球，但是生长很缓慢。。。我想下次将培养基里面的因子加倍不知道可行不可行呀

zb_ming

这个没试过，不过楼主可以尝试一下，做个对比，也许可行。实验本身没有定论。