各位大神帮忙看看ips状态怎么样

pjlsyz

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0 d' v: y- h+ C# X% W* h" t8 E! q! F0 n8 D1 x" m' `7 j
用计数板计的，数的是四个大方格，相加后除以4，我一个大方格里面将近有100个细胞，我细胞悬液是10ml，这样一算不就有1千万了么

eyerlong

嗯，计数是没错。师兄说你那个细胞状态还行，消化的时候你是怎么做的？你的克隆看上去太散了。

pjlsyz

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/ a6 H3 c4 o) ^5 \7 Z
我用生命的胰酶替代物消化5min，离心了两次。按1：5-1：10比例传代。

pjlsyz

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: _; l5 O; R$ w2 T1 w
/ d1 L( J) C# @最近养细胞有点奇怪的是feeder里面好多黑点，养的时候没有，消化后就都出来了，也不知道是不是污染了，用这细胞做EB也做不出来，又重新复苏了一只，发现复苏的细胞直接丢孔里，自己就可以形成EB了。

eyerlong

师兄的经验是miPS消化时间不要太长，尽量不要让克隆太散。我养的是hiPS，所以对于你的EB情况不太了解。

pjlsyz

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7 L. s9 y1 _: o. [  M: ^
" X3 A$ e  U* v: S+ [* Y' }- m但是我看有人说克隆一定要吹散，不然容易分化。

ligangtiancai

1. 这么密的细胞肯定是不行的，克隆之间相互接触会导致细胞更加容易分化，而且这样的克隆密度你的MEF也是受不了的；8 y! d7 }2 j0 A9 X( b# \+ a
2. 1000万的细胞量估计计数也没有问题，因为虽然1个t25所能收集的细胞上限理论上是500万左右，但那是对于平面生长的，而对于是克隆生长的iPS而言细胞数自然会多一些。3 k: y3 N' h: n: `. N/ d
3. LZ的克隆总体来说状态还可以，第二张图中克隆多数虽然有变形，但是形态饱满，立体感不错，边界清楚，还不属于分化了的克隆，只是密度太大。依照小鼠iPS的经验，下次可以在生长2.5天后1:20-30进行传代，细胞状态自然会慢慢恢复

pjlsyz

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; z$ N! Q" f' a- s; m
: W4 }1 U( X  f6 v4 w这个是由于我之前想快点把细胞扩起来，所以是按1：5的传代比例传的，细胞长的特别密，现在我是按1：10-1：15的比例传的，细胞状态马上好起来了，看起来比这个饱满多了。

ligangtiancai

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% ?0 @( J2 `4 R7 n5 ~这个细胞扩增起来很快的，但是密度一定不能太大，平均一个低倍视野（X40）有10个左右克隆就可以了

pjlsyz

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) P3 }  |# z7 f" s4 k$ s9 n5 s) ]) N7 \  m- n1 {" l9 p8 ]
那我密度真大了，一般都到100x下有十多个克隆了。0 {( a6 s9 l5 O* d# L% N" f
谢谢分享啊！