各位大神帮忙看看ips状态怎么样

pjlsyz

回复 eyerlong 的帖子% n3 y" ~5 Q0 F" \) D
+ ^6 q' K1 V0 @$ S8 L$ n* s
用计数板计的，数的是四个大方格，相加后除以4，我一个大方格里面将近有100个细胞，我细胞悬液是10ml，这样一算不就有1千万了么

eyerlong

嗯，计数是没错。师兄说你那个细胞状态还行，消化的时候你是怎么做的？你的克隆看上去太散了。

pjlsyz

回复 eyerlong 的帖子
2 w, `) ~9 ?5 J0 g) A4 G$ W. `8 O. F: _$ F# h1 E
我用生命的胰酶替代物消化5min，离心了两次。按1：5-1：10比例传代。

pjlsyz

回复 eyerlong 的帖子
8 W- a4 T6 F/ d7 M' H3 N9 t
1 a9 O5 |  M' n2 b最近养细胞有点奇怪的是feeder里面好多黑点，养的时候没有，消化后就都出来了，也不知道是不是污染了，用这细胞做EB也做不出来，又重新复苏了一只，发现复苏的细胞直接丢孔里，自己就可以形成EB了。

eyerlong

师兄的经验是miPS消化时间不要太长，尽量不要让克隆太散。我养的是hiPS，所以对于你的EB情况不太了解。

pjlsyz

回复 eyerlong 的帖子
; _6 M) O2 F) M: z( L; U  i6 j3 |# F0 W, f
但是我看有人说克隆一定要吹散，不然容易分化。

ligangtiancai

1. 这么密的细胞肯定是不行的，克隆之间相互接触会导致细胞更加容易分化，而且这样的克隆密度你的MEF也是受不了的；) U, ~) Y& I+ ]; t
2. 1000万的细胞量估计计数也没有问题，因为虽然1个t25所能收集的细胞上限理论上是500万左右，但那是对于平面生长的，而对于是克隆生长的iPS而言细胞数自然会多一些。
% i+ l: N- R" J. ^! {' i0 |2 d( n3. LZ的克隆总体来说状态还可以，第二张图中克隆多数虽然有变形，但是形态饱满，立体感不错，边界清楚，还不属于分化了的克隆，只是密度太大。依照小鼠iPS的经验，下次可以在生长2.5天后1:20-30进行传代，细胞状态自然会慢慢恢复

pjlsyz

回复 ligangtiancai 的帖子  @3 P8 N. \% A! H: ~- p3 P% M" [
1 p- u+ R' ^) S1 _
这个是由于我之前想快点把细胞扩起来，所以是按1：5的传代比例传的，细胞长的特别密，现在我是按1：10-1：15的比例传的，细胞状态马上好起来了，看起来比这个饱满多了。

ligangtiancai

回复 pjlsyz 的帖子
# a- r, }9 ]  M- e9 k8 o9 K# Z/ h* f& P( M4 t7 l( O% Z4 F
这个细胞扩增起来很快的，但是密度一定不能太大，平均一个低倍视野（X40）有10个左右克隆就可以了

pjlsyz

回复 ligangtiancai 的帖子
3 d5 `5 k/ \. ]' A: r2 R$ j* u( f8 J# o7 S, o8 V! e3 L
那我密度真大了，一般都到100x下有十多个克隆了。
  O7 @  s! F( b  O/ t6 P' L! A谢谢分享啊！