关于RT-PCR

moluxingke

最近在做反转录PCR，组织提取RNA，然后反转cDNA，稀释大约500以后再做普通的PCR，用了36个循环，结果跑电泳的时候发现GAPDH亮度差异很大，按理来说，用1ug的RNA反转，cDNA含量应该差不多的，但是经过PCR之后内参差异怎么会这么大，有时候做Real time也是这样，同样的RNA反转之后，GAPDH的CT值有的是15，而有的就是16了。提RNA后测浓度有的大于1500ng/ul，也有的不到500ng/ul，是不是反转的时候把RNA浓度调到一样的浓度会好点？除了反转的时候加样不均，或是RNA里面有DNA污染外，还有其他什么因素会导致内参不齐？请不吝指教？谢谢

小等

不同模板的CT值差1,2个，属于正常现象吧，这就为什么要做内参的意义吧

jiojoo

ct值15和16，其实不能算作有明显差别8 y7 q( B2 [; j5 Q& _4 ^' ]7 U
因为影响ct值的因素太多了" @, }7 S" h( R. _. p9 w" J7 P
不知道你测量RNA之前，有没有跑过RNA电泳，RNA中混有基因组的差异，RNA完整性的差异，反转时反转录酶反转效率的差异都会造成内参ct值的变化
" w! [6 P3 O9 i0 A2 u反转时，为了尽量准确，是要把RNA的起启量控缺在一致的水平比较好
2 v. z* R/ o; j% l: \5 R/ |不过还有一点是，GAPDH也不是说完全稳定的
" [0 R+ w4 |- {+ V9 _给你一篇相关文献看一下吧' C! Z1 b+ u2 n5 t/ |& h  R/ k
http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0064786

moluxingke

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; Q3 m. r6 J: @4 ^/ p
% S3 U: D8 c- I( J: f  L' P- z嗯，有道理，不过我现在都是把提取的mRNA稀释到相同的稍微比较低一点的浓度，一般500左右，这样加样导致的误差尽量减少，反转后做QRT的CT值基本一致，一般不会相差到2.大多情况下基本一致。

moluxingke

回复 jiojoo 的帖子( d( T% h( M  @1 ]
7 T( h5 B: t0 B  `0 @  l# P
谢谢帮助，现在做反转录之前，我都是把RNA的浓度调到大致差不多，情况明显有好转。

zarecol

再给你一点建议：平行试验用一个牌子的试剂盒