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标题: 脐带间充质干细胞的分离培养 [打印本页]

作者: 马锡慧 时间: 2010-6-17 10:19 标题: 脐带间充质干细胞的分离培养

大家好，我想向大家请教一下：脐带间充质干细胞的分离有两种方法，组织块贴壁和酶消化法3 i( x1 S; N, i
去血管和羊膜后，取华通氏胶剪碎后，若是组织块贴壁法，怎么操作才能使组织块很好贴壁呢？若是用胶原酶消化，是不是用胶原酶2啊？要消化多长时间为宜啊？具体的操作步骤是什么呢？

作者: taoqilh 时间: 2010-6-17 10:27

回复 1# 马锡慧 5 B, Z' p1 e( G# I" Q
我们自己做的大多使用的是酶消化法，因为组织块贴壁法爬出来的细胞大多都是上皮细胞，在使用酶的时候，我们用的是1型胶原酶和透酶，

作者: wuxiao101325 时间: 2010-6-17 10:29

组织块没怎么做过，消化法可以参考：http://www.stemcell8.cn/thread-18220-1-1.html

作者: taoqilh 时间: 2010-6-17 10:29

至于消化时间，我们现在使用的是胶原酶和透酶消化一小时，完了再用胰酶消化半小时，

作者: 马锡慧 时间: 2010-6-17 10:35

回复 2# taoqilh

# ~2 M3 G0 B+ G& ^. z; s( |; Z9 Y
请问，你们的分离效果怎么样啊？" F" U* F# \( k) {. D
我只用胶原酶1消化的，可是细胞数太少了) m* S" q1 W5 f$ N2 h
能发依一下你们的操作步骤吗？

作者: wuxiao101325 时间: 2010-6-17 10:37

忘了你不能下载：
脐带MSCs培养操作规程
1 无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的PBS中，玻璃容器密封送回实验室；2 F+ H8 |. Q' M- O
2 超净台上剪取合适长度脐带，用PBS洗净血污；% g- }2 J* |7 R) L) d: Q
3 将脐带剪碎成肉糜状（2-3mm3），转移到100ml玻璃瓶中，每2cm脐带加入4ml的消化液（含0.25%胰酶，200~400U胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃摇床（150rpm）消化1小时；
4 将含组织块的消化液，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12(Gibco,cat no 12400-024)培养基（含15%胎牛血清Gibco, Ref 10099-141），37℃、5%CO2孵箱培养；0 {# K- h+ }8 i$ l$ ^
5 约三天左右能在显微镜下观察到贴壁细胞，首次换液时间为接种后24-48H之间，半量换液后继续培养，三天后换液，细胞已经能稳定生长。每三天换液一次，至细胞80%融合（约10天左右），即可进行传代；
6传代时去除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞2次，加入1.5ml的消化液（含0.25%胰酶的PBS液），37℃条件下作用5-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到15 ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清，用适量DMEM/F12培养基重悬细胞，进行活细胞计数并计算细胞活率，以适中浓度1000—5000个/cm2浓度进行铺板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。- T3 ~& K9 w, i1 v7 \
7 细胞冻存时，按传代的操作步骤获得细胞沉淀，用冻存液（30%FBS＋5%二甲基亚砜+DMEM/F12培养基）重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ ml左右，将细胞悬液转移到冻存管中，1ml/管，用程控降温仪降温后转移到液氮中冻存。

作者: study 时间: 2010-6-17 11:21

我做过组织块贴壁法的，细胞贴壁太慢了，大概14天左右才传代，还是用酶消化法能快一些

作者: 马锡慧 时间: 2010-6-17 12:06

回复 7# study # h! a4 Y* R% L E6 \! c* H; K
5 g; x' }7 T* l# k0 `8 y

请问你用的胶原酶几型啊？

作者: xixitao 时间: 2010-8-3 09:42

我用的2型胶原酶，文献上消化时间弹性很大，个人认为十小时左右，最好多观察消化状态

作者: lchanlon 时间: 2010-8-17 11:59

回复 9# xixitao ! q' y4 k" `/ e* }
+ f" U4 ]; X. }7 ~4 H: B8 R: b

用4型的胶原酶做可以吗？

作者: cl5823283 时间: 2010-8-18 10:57

我有师兄也是用IV型胶原酶，但我自己用II，感觉差不多

作者: 鹭岛之滨 时间: 2010-8-19 10:21

我们用的是贴壁法，但和wuxiao101325 的方法不一样，效果也还不错呀

作者: hospitalshy 时间: 2010-8-28 15:37

我也刚刚开始养hUCMSCs，希望能留个邮箱联系方式能够与你交流

作者: willow0711 时间: 2013-4-9 09:42

回复 wuxiao101325 的帖子

刚接触这方面，想问下，你的组织块怎么除去呢？谢谢

作者: get0715 时间: 2013-4-9 11:31

我自己没有做过消化法，但做了很长时间脐带间充质干细胞分离的老师说的是组织块法爬出来的细胞比较纯，消化法杂细胞较多，且方法步骤多，污染的几率就增加了。我们一直都是将剪碎的组织块直接加到培养基中悬浮着培养，不用等贴壁了再加培养基，这种方法就是时间长，差不多要12天到14天才能传一代。个人认为组织块法可能较消化法分离出的细胞少。

作者: deshenglll 时间: 2013-4-12 15:09

各有千秋吧。我们主要是用的组织块法。酶消化前期时间比较长。组织分离法现在做一份在35min左右。

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