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标题: 请教脐带间充质干细胞培养方法 [打印本页]

作者: mason658616 时间: 2011-5-10 10:40 标题: 请教脐带间充质干细胞培养方法

组织块法和胶原酶消化法哪个比较好？我现在用组织块，但是爬得很慢啊，2周了是不是应该有动静了？
胶原酶法我查了查文献，有用2型的，也有用4型的，哪个比较好呢？( W. }9 I2 i7 c( l/ t
取华通胶好费劲，尤其是要把动脉静脉剥离下来，每次都得弄一两个小时，大家做过的有没有什么经验分享一下？

作者: gaorongbest 时间: 2011-5-10 11:19

回复 mason658616 的帖子 j. x- Z* }/ t' ] b1 v
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我最近也在养脐带间充质细胞，用过酶消化法，但是没有成功过，细胞量很少；用组织块培养的话7-10天就有较多的细胞爬出来了，12天之后就可以传代了，组织块不能漂了，一旦漂了就不会有细胞爬出来了

作者: tingwuyu 时间: 2011-5-10 16:31

组织块法10天左右就可以爬出细胞了，建议选择好的脐带，尤其是那种粗的，这样取华通胶也比较方便，细胞也较多。另外，剪得碎一点

作者: mason658616 时间: 2011-5-10 16:40

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3 x, N3 y# J& q9 a# a7 Q' z$ K/ q7 K
谢谢。我第一次做的组织块都漂了2周了，没有细胞。第二次的有5天了，这回剪得比较小，而且先底朝上放置了4小时，然后底朝下加了3培养液。现在看组织还贴着，但是还没有细胞爬出来。我该不该换液?我的培养基就用的10％FBS的H-DMEM，可以吗？

作者: mason658616 时间: 2011-5-10 16:42

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再请教下，用PBS洗干净脐带后要不要在培养基里剪？我觉得干着操作还稍微容易点，有水的话特别滑，但是组织块干着是不是对细胞不好啊

作者: 福牛 时间: 2011-5-10 21:50

两种方法都用过，总体来说，酶消化法细胞爬出来的快一点，也要多一点，胶原酶过夜加胰酶半小时左右，3天左右能见成纤维样细胞，7到10天可第一次传代。组织块法觉得剪刀功夫要好，别怕累，越碎越好，最快的3天也见过成纤维样细胞，但量比酶消化法要少。还有，用的培养皿也有关系，好的皿和差的皿，原代培养所用时间差距很明显。

作者: 福牛 时间: 2011-5-10 21:55

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如果操作时间太长，细胞一直干着，的确对细胞有害。不过加培养基以后基本无法剪到很细了，我还是坚持让它干着……，不过操作快了以后，貌似影响不大。

作者: yanmin 时间: 2011-5-10 22:09

我最近也是在做脐带间充质干细胞的培养，每次剪碎组织后，可以看到有游离出来的细胞，但是细胞一直不会贴壁，我操作的时候是将组织块剪碎后，分别用胶原酶II和胰酶消化，消化后，组织块通过滤网过滤，过滤后的组织块用于贴壁（但是会出现组织块很黏稠的现象，这样会不会影响细胞贴壁？），滤出的细胞通过离心后，用培养基重悬后，于培养瓶中培养。但是现在已经培养十来天了，有细胞，但是细胞不会贴壁，想请教一下大家，来帮我解决一下问题。。。

作者: yanmin 时间: 2011-5-10 22:11

我最近也是在做脐带间充质干细胞的培养，每次剪碎组织后，可以看到有游离出来的细胞，但是细胞一直不会贴壁，我操作的时候是将组织块剪碎后，分别用胶原酶II和胰酶消化，消化后，组织块通过滤网过滤，过滤后的组织块用于贴壁（但是会出现组织块很黏稠的现象，这样会不会影响细胞贴壁？），滤出的细胞通过离心后，用培养基重悬后，于培养瓶中培养。但是现在已经培养十来天了，有细胞，但是细胞不会贴壁，想请教一下大家，来帮我解决一下问题。。。要补充一下，我也做过组织块直接贴壁，是不是要将组织块剪得很碎？大家是取的那部分材料来用于实验呢？是将静脉动脉都去除的组织吗？

作者: tangyvhuang 时间: 2011-5-10 23:21

楼主的头像有点另类

作者: tangyvhuang 时间: 2011-5-10 23:27

组织块培养的话，组织块要剪碎然后小心的贴到培养皿底，组织块之间距离不要太大，培养液要三天一换的，我一般用低糖的DMEM不用在培养基里面剪碎，不干了就好，但是也要注意别拖拖拉拉的很长时间，8 b% ]/ v3 a- w6 O& n
酶消的话，2型跟4型都可以，我比对过没有什么明显差别，，今天没心情细说。

作者: tangyvhuang 时间: 2011-5-10 23:33

yanmin 发表于 2011-5-10 22:09
, r9 }' |4 Q8 G/ B% ]7 a我最近也是在做脐带间充质干细胞的培养，每次剪碎组织后，可以看到有游离出来的细胞，但是细胞一直不会贴壁 ...

我觉得酶消之后的参与组织块再贴壁不会有细胞爬出来的，我以前试过没什么结果。过网晒？这时候的消化液很粘稠吧，之前要大量稀释一下的，我觉得你过完网筛之后的东西里面没有什么间充质了吧，是不是都是红细胞之类的小细胞了吧

作者: gaorongbest 时间: 2011-5-11 08:34

回复 mason658616 的帖子. a3 `' @! |2 G# g) Z: k5 A2 q' k
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我们都是用皿接种，没用过瓶子，你可以半量换液，一般用D-F12培养，没用过高糖DMEM，你可以对比一下

作者: leungyk 时间: 2011-5-11 11:17

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我也正在試，還未成功！' S/ V# r9 ^% y8 G0 k& i5 k0 R! w' j
用组织块~ 得一点点細胞爬出來，但不太像MSC
我們是用一型胶原酶的~ 也試過2型，沒太大分別

把动脉静脉剥离，初初是有点煩，但慢慢就變得熟練了，我會用剪刀在中間剪開，不會分成小段，用鉗子撕開組織，动脉静脉就自然走出來，拉一拉就可以了！# V( L- t5 d! V- P0 T7 e
6 O0 }9 T4 X8 D# }
成功的前輩們，你們是用什麼培養液的？
我正在試 DMEM/F12+15%FBS, StemPro, MesenCult, 10天了，只得幾個細胞走了出來！
唉~

作者: mason658616 时间: 2011-5-11 14:59

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我的细胞从贴组织块到今天6天了，一些组织块周边似乎有往外爬的迹象，组织块是贴着的，但是外周是漂着的。我没用酶消化，就是把脐带外膜和血管剔除后，取的华通胶，剪得尽可能小，先贴在底上，把培养瓶底朝上养4个小时，再加培养液，底朝下正常养着。要是养脐带MSC应该是不要动静脉的，否则养出来东西比较杂。因为脐带可以养内皮细胞、干细胞和间充质干细胞。

作者: 福牛 时间: 2011-5-11 21:54

回复 yanmin 的帖子3 ^) S/ T- l$ K- j! P6 x7 _
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不知道你用酶消化多长时间，我认为酶消化后对于本来就很细的组织快会有一部分细胞爬出来，如果过滤掉只剩余组织块是不是有点浪费。我没有过滤过组织块，消化后用生理盐水洗涤离心后接皿。换液时候自然把组织块换去。两种方法一般都要去除静动脉和羊膜，剩下的组织要剪的很碎，大约一立方毫米左右小块，越细越好，加培养基的时候别太多，把组织块飘起来的话不利于细胞贴壁。

作者: sj842563 时间: 2011-5-12 09:27

我正在养，酶消化和贴壁都养出来过，但是还没等鉴定呢就都老化了，而且实验的重复性也不好，

作者: zhangmingqi111 时间: 2011-5-12 10:31

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请问一下怎么保证贴壁的组织块不漂起来呢？

作者: leungyk 时间: 2011-5-12 10:36

回复 zhangmingqi111 的帖子9 P, A9 _2 T5 R/ I

我用這個方法:
剪碎以后均匀铺开组织块，倒置培养皿，放入37°培养箱，一个到一个半小时取出，延边源缓缓加入培养基，一定不要冲起组织块，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，再多加点，放入培养箱内，不要动，一周后上镜看6 ]% V$ b2 q6 ^0 _: H* L! Q
效果很好，漂起的不多

作者: cactus006 时间: 2011-5-12 11:31

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您好，怎么能让组织块不漂呢？如果培养瓶是否需要包被呢？

作者: mason658616 时间: 2011-5-12 15:15

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用吸管把组织块一个一个加到培养瓶了，摆放好后可以把多余的液体吸出来，然后盖好瓶盖把贴有组织块的底面朝上，放在co2箱中待两三个小时再取出，加培养液的时候一定要小心，让液体从没有组织块的一面流下去，不要加太多，2－3ml就够了，然后慢慢放平培养瓶，让培养液接触到组织块即可，不要使劲晃。在镜下观察的时候也要动作轻，别把组织块晃下来。

作者: yanmin 时间: 2011-5-12 16:07

回复 tangyvhuang 的帖子" L5 r3 V8 c% G) B/ O$ G' t
( M! P7 c& J" {" r) @+ s
我昨天又做了一次，用胶原酶消化过夜，然后第二天早上又用胰酶消化，消化的组织块过筛网，滤液离心，离心下的沉淀用低糖DMEM重悬后，铺到培养瓶中，在镜下可以看到细胞了，现在就看细胞能不能贴壁生长了

作者: yanmin 时间: 2011-5-12 16:09

回复 leungyk 的帖子# m2 Q0 Z Q+ @# `

我想请问一下，你是大概加多少培养基呢？在放置的这一周，不用补充培养基吗？组织块会不会干掉呢？

作者: yanmin 时间: 2011-5-12 16:34

回复 mason658616 的帖子0 r- t& T3 J" }' d1 p* d: C1 e

谢谢~我昨天做的时候就把动脉和静脉都去除掉了，我下次做打算试试匀浆，因为用剪刀剪总是剪得不是那么碎，看起来组织块已经很小了，但是铺到瓶子里的时候，还是觉得有点大了。

作者: yanmin 时间: 2011-5-12 16:36

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你是直接把消化后的组织块用生理盐水洗涤，然后离心，离心下来的细胞和组织一起用培养基重悬，然后铺板子是吗？

作者: leungyk 时间: 2011-5-12 16:41

本帖最后由 leungyk 于 2011-5-12 16:42 编辑
M H0 W, z+ N
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我也是放2-3ml，沒有換液，一個星期後並沒有乾~

作者: zhangmingqi111 时间: 2011-5-13 00:32

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培养瓶或皿倒置的目的什么呢？当培养瓶倒置时，根据重力作用，组织块会落到非培养面，然后再正置时，组织又会落到培养面上，为什么不直接让其在培养面上生长呢？

作者: henryjia 时间: 2011-5-13 05:30

真高兴有这么热烈的讨论，分享一下我的经验。
& i0 D) X& U5 {3 O, l7 s
首先我的经验发现用酶消化和切块消化没有明显区别-指分离出的细胞没明显区别，我是根据FACS表面抗原检测结果和成骨，成脂肪细胞分化功能实验结果来说的。其实切块法，很大程度是取决于胶原蛋白，弹性蛋白等ECM成分蛋白自然分解儿使得细胞释放，至少我的组块漂浮也一样在10天左右发现细胞长出。而酶消化法显而易见的提高效率。

作者: henryjia 时间: 2011-5-13 05:36

再说一下消化酶和时间的选择：

我是使用胶原酶I联合透明质酸酶，大约消化1-2个小时，此过成必须不停震荡！！！个体差异导致时间差异。尝试过继续胰酶消化，似乎意义不大。4 P+ o$ I( k# [
: ~! c* u! @* k, u l
不建议过夜消化，时间太长，细胞损伤很大。如果一定要这么长的话，要用含血清的培养液配置消化酶溶液，以保护细胞。
A9 k; n/ \- r6 M" o/ O
还有些要说，但是太累了，主要要点在这里了。找时间再给大伙补充。

作者: almasun97184 时间: 2011-5-13 08:33

先剥掉动静脉，此过程半小时。
然后我们是用各种酶的混合物消化16个小时，混合物比例不好透露，专利申请中。* g' r( x: r1 L2 X+ k; ?3 s" o! d
第二天就基本上看不到组织了，皿里头全是单个细胞和胶原。: O4 c# `7 ]) y
离心洗涤就能种植了，此过程半小时。
一周可传代，百发百中，细胞也没有明显损伤。

作者: gaorongbest 时间: 2011-5-13 08:41

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刚开始记得加一点点培养基，不要加多了，不然组织块就易飘起来，贴不了了，第二天补加一点，到第三四天时再半量换液，吸的时候要轻

作者: sunjianhua2000 时间: 2011-5-13 08:57

我也正在做脐带间充质干细胞培养，目前正在观察中，我用的培养液是L-DMEM+15%FBS，据说这种浓度比较好。随时关注你的实验，一起探讨。

作者: leungyk 时间: 2011-5-13 10:40

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這個~我不大清楚！我是從書裡看到的，還有這裡的師兄也提到這方法

作者: mason658616 时间: 2011-5-13 15:37

回复 zhangmingqi111 的帖子8 t* F5 J& X9 e q8 S: u0 ]

一般不会掉下来吧，把组织剪的越小越好，放进去的时候液体不能带太多液体，如果液体比较多就用吸管吸掉，让它靠组织上的一点点液体贴在瓶上。反过来的时候小心点，一般不会掉。如果直接就在底面加培养基很容易把组织块冲起来。

作者: mason658616 时间: 2011-5-13 16:04

回复 henryjia 的帖子
& g2 l1 T3 _1 e* O$ i" t: V" X
请问一下，组织块开始往外爬细胞是什么样的？我没见过，也不知道我养的是不是开始爬了。我观察的是组织块光滑的边缘出现像裙子边样的表现，毛毛糙糙不光滑了，有些单层能透光的细胞。还有的是像触角或者枝丫的感觉往外伸。就是不知道是我撕拉的组织块的边缘还是爬出来的细胞，因为刚接种的时候没有在镜下看

作者: mason658616 时间: 2011-5-13 16:06

回复 yanmin 的帖子5 V* E0 q4 C3 x
7 c/ W% b2 L1 ^, e/ B- }4 W
我还没有匀浆，也打算试试，期待你的结果分享啊，呵呵。

作者: mason658616 时间: 2011-5-13 16:28

回复 cactus006 的帖子" u% q: M8 U' |9 o4 C& |' F2 U
9 W8 X7 [3 v" E4 r5 E L
有不少回复怎么让组织块不漂的留言，你可以看看。培养瓶我用的是一次性塑料的，不知你说的包被是怎么弄。塑料的比玻璃的更容易贴一些，自我感觉。

作者: henryjia 时间: 2011-5-13 18:22

回复 almasun97184 的帖子

不说比例，就告诉有什么酶行吗？

作者: mason658616 时间: 2011-5-14 09:41

回复 henryjia 的帖子
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胶原酶和胰酶，你可以查查文献，有的用胶原酶消化30min再用胰酶消化30min，也有的只用一种酶，也有的用这两种酶但消化时间不一样。胶原酶有用2型和4型的，好像没啥差别。但是提醒你消化完之后会比较黏稠，不好过滤，可以把较大较黏的组织挑到另一个平皿里，多吹打吹打，吸取上清，把沉淀去掉。如果还是黏稠就稀释一下再滤，否则可能把有用没用的都丢掉了。

作者: almasun97184 时间: 2011-5-15 20:19

还要加透明质酸酶，可以消化完全，不用过滤。

作者: 农夫有点田 时间: 2011-5-16 00:15

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您说的培养皿可是T75培养瓶么? 这个真的跟培养瓶有关系啊？我和想知道http://www.stemcell8.cn/thread-39788-1-1.html 这是我发的帖子

作者: 福牛 时间: 2011-5-16 22:54

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恩，是的，我一般一根脐带根据所留取的组织量多少，用400到800ML生理盐水洗涤，然后接皿，3天左右换去半液或直接补充几毫升含血清的培养基。用酶消化法的话，印象中三天都可以见贴壁细胞的。

作者: yanmin 时间: 2011-5-17 13:44

回复 almasun97184 的帖子

我用的就是胶原酶消化过夜，然后在用胰酶消化半个小时，是看不到组织块了，离心后也可以看到细胞了，但是细胞不会贴壁生长，请问在培养基里还需要添加什么生长因子之类的吗？还是需要包被板子？

作者: yanmin 时间: 2011-5-17 13:47

我现在通过酶消化可以分离出单个细胞来，但是细胞不会贴壁生长，想请问一下是不是在细胞培养的时候需要加入什么生长因子？还是培养基的PH需要调节？还是需要包被板子？谢谢~~~

作者: mason658616 时间: 2011-5-18 22:51

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问一下您的酶各自消化多长时间？常温吗？用不用一直摇着？消化完很粘稠怎么解决，我看有人说用透明质酸酶，不知是否可以。这些酶消化终止的方法都是加含血清培养基吗？

作者: yanmin 时间: 2011-5-19 14:19

回复 mason658616 的帖子: p, s% }7 n: I `/ v# K

我没有用过透明质酸，我是用胶原酶消化过夜后再用胰酶消化半个小时，消化后消化液很黏稠，我是用含血清的培养基终止的。细胞是出来了，但是就是不能贴壁。。。。

作者: mason658616 时间: 2011-5-20 11:07

回复 yanmin 的帖子

我昨天做了一次胶原酶消化的，是这样做的：把组织块放离心管里加2-3倍体积的胶原酶，37°摇30分钟，此时还有组织块，过滤，取滤液离心，但是我怀疑上清里也有细胞就把上清倒在一个单独的培养瓶里了。沉淀用PBS洗两遍，再用培养基悬浮，接种培养瓶。镜下观察上清和沉淀均有不少细胞，当然沉淀的细胞量更大。剩下的组织块又加胶原酶37°摇30分钟，相当于总共消化1小时，但这遍的细胞数明显少很多，几乎没有细胞。还是有残余组织块，我又用胰酶消化了30分钟，还是有组织块，这次就连组织块和细胞悬液一起放瓶子里了。5 ?9 \* t7 `( T5 n! x+ S
不知组织块不消化完全会不会影响细胞的量和生长，今天看看贴壁怎么样，再来汇报

作者: mason658616 时间: 2011-5-21 08:20

昨天看了下细胞，上清细胞不少但都不贴壁，看来可以弃掉，不用心疼。其他瓶都有贴壁，尤其是第一次消化的。但是根据养骨髓的经验，爬出细胞的多少跟细胞密度关系不大，小黑点是关键。我也是刚开始养，还请各位帮忙分析

作者: zhangruiting 时间: 2011-7-29 16:45

我们实验操作中用的是胶原酶消化法生长比较快一般三四天就有细胞长出不过其中分离的时候比较麻烦最好选用比较粗的脐带并且血流量少的整个处理过程最好在一个小时完成这样对细胞的损害也比较小

作者: saintwang6521 时间: 2011-8-2 17:03

我也是分别用胶原酶II和胰酶消化，消化后，组织块通过滤网过滤，会出现过滤液很黏稠的现象，过滤后的细胞也不多，求助！

作者: mbpsky 时间: 2011-8-4 14:05

回复 mason658616 的帖子) K2 y% X" ^1 e2 O5 n
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两种方法培养出来过。一般而言，我喜欢用组织贴块法，而且我喜欢用T25培养瓶倒置干涸法。脐带优质的话，第三天就可以爬出来，一周内就可以完成原代原代培养进入传代。当然，爬出来的时间与脐带质量有关系。而且量很大啊，你只要用一小丁点组织，你就可以获得一瓶细胞。而且省酶省时间，一次操作一个半小时搞定所有原代分离接种。: `( x& F3 l; P+ q0 K3 H' e8 J5 Z

关于酶消化法。胶原酶过夜加胰酶4小时左右，一般的话，5天左右能见成纤维样细胞。但时间和精力消耗大。一拖那么长时间。还费酶。4 x, a) G9 h6 X

不过细胞的爬出快慢，还要取决于你对两种方法的熟练度和培养基的优良度，并非一概而论

作者: wangweilie0418 时间: 2011-8-15 08:58

看文献酶消化法可以用单酶法及双酶法，至于我们做用的是组织块培养。也就是前面有人说过的倒置干涸培养，一般贴了壁的组织块均有细胞爬出，甚至有些贴了不久就掉下来的都有细胞长出，最好是在换液时仔细的观察，刚刚长出来的细胞挺不容易被看见的，观察时主要看组织块周围和有贴痕的地方。个人感觉这种方法还是比较容易培养的。

作者: mason658616 时间: 2011-8-16 20:46

回复 mbpsky 的帖子2 \$ f' I! j5 T/ D3 A3 p
( ^+ r9 r0 [$ f3 n
谢谢，讲得很详细。我好久没做脐带了，一直在养骨髓的。因为之前的脐带都失败了，不敢养了，呵呵。可以再试试看。再次感谢啊！

作者: mason658616 时间: 2011-8-16 20:47

回复 wangweilie0418 的帖子 V( V% r9 V; k# i
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我也觉得组织块贴壁法要好，酶消化法很难有细胞贴壁

作者: Demon_820 时间: 2011-9-20 10:12

我也是养脐带干细胞的!我用的是纯组织块培养法!分离剥胶有技巧.先将脐带分段,沿
动脉将血排出(血多会影响胶纯度。也影响视线分辨率。你懂的)。用应用弯头剪刀沿静脉剖开,用2:1组织镊去除静脉壁!将两条动脉用镊子撕成裸露状态,然后剔除!这样剩下华通氏胶和羊膜$ x: |# _' j p. U" {/ [

作者: mason658616 时间: 2011-9-22 10:20

回复 Demon_820 的帖子8 `0 ?' a/ R. e+ o1 s+ X

讲得很详细，多谢！再问一下2：1组织镊是最小号的镊子吗？我感觉把静脉剖开后很难分辨静脉壁和华通胶，直接用镊子把静脉壁扯掉会不会同时损伤要留下的华通胶的细胞呢？我只是去除动脉，感觉还比较容易，静脉没剥过，下回试试。您做的时候羊膜还剥掉吗？我是直接从上面剔组织，没剥羊膜。

作者: dophins 时间: 2011-10-15 17:29

最好的是将动脉及静脉去掉，有利于细胞的爬出生长

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