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标题: western检测磷酸化抗体 [打印本页]

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-18 15:43 标题: western检测磷酸化抗体

最近在网上查看关于WB的一些常见错误，有一条说检测磷酸化抗体的时候不能用脱脂奶粉封闭，不知道各位有谁验证过这条，我前期做过一个磷酸化的抗体检测，一个月的wb都没做出一张漂亮图片，不知道这是否就是原因所在，请指教

作者: jhu132llh 时间: 2011-7-18 17:28

是滴* b# V; o' J4 t, S9 Y9 l- |5 G+ E; L
很正确
检测磷酸化抗体都用BSA
不能用脱脂奶粉的原理忘了，反正是有这样一条

作者: pheebs 时间: 2011-7-18 20:22

没有吧，我用脱脂奶粉封闭后检测cell signaling的一些磷酸化抗体，效果很好啊！

作者: pheebs 时间: 2011-7-18 20:26

google了一下，“我在abcam公司WB protocols上看到，之所以不用脱脂奶粉来封闭磷酸化蛋白，是因为脱脂奶粉里含有酪蛋白（casein），由于也是一种磷酸化蛋白，所以磷酸化一抗会跟酪蛋白非特异性结合引起高背景”。但是我从来没有遇到过这种情形。我裂解细胞的时候碗里头加了磷酸化酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，一直用脱脂奶粉做，条带都是很明显的。

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-19 09:12

本帖最后由 mayansen1314 于 2011-7-19 09:15 编辑 . {+ `" [! k9 ^& d& m3 q3 a9 m

回复 pheebs 的帖子
3 ] _" J- _2 J
我用脱脂奶粉封闭过，当时的背景就是很高，黑黑的一片，当时我以为是一抗二抗没洗干净，后来又做了几次都是一样，当时就没注意到他们说的这一条。

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-19 09:16

回复 jhu132llh 的帖子6 E( e4 f3 `; R ^

http://www.stemcell8.cn/thread-43456-1-1.html

作者: jhu132llh 时间: 2011-7-19 10:53

good

作者: james_0619 时间: 2011-7-20 20:28

我做过，确实用牛奶封闭做不出好的效果，实验室有人用0.5%明胶来封闭,做出来的效果不错,我做的是磷酸化的ERK

作者: sallyshaomy 时间: 2011-7-21 09:28

用牛奶或者BSA封闭对实验结果影响不大，你的磷酸化蛋白分子量是多少？我觉得WB关键步骤在于转膜，不同分子量的蛋白其转膜时间差异较大。你试着摸索过转膜时间了吗？

作者: runsong 时间: 2011-7-26 12:04

回复 james_0619 的帖子, i8 t6 p% |, O

磷酸化ERK的抗体你是在哪里买的，我最近也要做。

作者: james_0619 时间: 2011-7-26 19:03

回复 runsong 的帖子' Y9 C; W1 P9 |+ l# m3 P" N& n. }
# l: t2 t& C$ [
我是用的师兄留下来的抗体，你想知道批号什么的吗？我帮你打听一下吧，我之前做的，所以没记住

作者: y6064031 时间: 2011-8-9 09:45

作者: 芷瞻 时间: 2011-8-9 10:21

runsong 发表于 2011-7-26 12:04
0 m4 ^7 C- C5 P3 Y回复 james_0619 的帖子- z3 `% ~' P! V' N) P8 U8 m

' G! h# U; n% {" ]( D/ H磷酸化ERK的抗体你是在哪里买的，我最近也要做。

* T- d& P& j" F% b- Q# x" }: `* p
可以选择Abcam公司的产品, ab50011, 我最近一直在做,比较好用,供你参考

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