干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: ips全军覆没，我该怎么办？ [打印本页]
作者: rongrong    时间: 2011-9-4 11:45     标题: ips全军覆没，我该怎么办？

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了
作者: oucflora    时间: 2011-9-4 13:05

冻存时DMSO浓度过低；# ]( _6 r' p( b# U
另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？
作者: evial    时间: 2011-9-4 14:38

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做
作者: Yedan    时间: 2011-9-4 17:21

回复 oucflora 的帖子
2 Q" `7 F% ?5 w3 y
$ H2 d! ^" k( A6 [( D10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……
$ Q. }1 S; v8 A6 b. `
作者: Yedan    时间: 2011-9-4 17:22

回复 rongrong 的帖子- o6 u1 K$ ~# A- D" M
4 e8 w" H- U& y" g, O
800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？
7 ~# l# F) P4 R# {7 G8 U我们实验室从来都是1200rpm的。。。( ~- B6 o2 y1 s" ?) B

9 I1 D. B! i- V; a; j补充内容 (2011-9-4 17:27):
3 P% w- n9 B. B2 ^8 q另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。
作者: oucflora    时间: 2011-9-4 23:01

回复 Yedan 的帖子
9 U# U7 p/ H9 D' K- M+ [  p% v' a5 h+ e' s
在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。
作者: jefferson    时间: 2011-9-5 10:18

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了.  对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意:
) F2 p& B( `6 Z, n  w4 C, K& D
# O  y: \3 H5 K1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.+ i. l, G" o. _0 w
2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作: X* {6 l. F7 K1 \
3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.* X% R8 D: X6 F
4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定. + s1 g. L+ |4 z: B+ S0 p& Z
5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 11:41

回复 oucflora 的帖子
% {+ ^. P" J; k# C: m$ {7 D- p, G9 G$ _: J% m3 @4 X
我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 11:42

回复 evial 的帖子  c* I# L1 q# b$ o( ?3 m1 D

. y5 X6 s. \: F4 j! u, o英文版是啥啊？我是新手，好多东西费了包包但是不能下载啊
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 11:45

回复 Yedan 的帖子
8 W! z( p( ]3 a8 z* k- m; t
$ i6 P; l, W9 i' X是人的，800转看起来是全部离下来了，我听别人说他们都是静止放5分钟就好，主要我得细胞都变成单细胞了，不再像以前那样一个个克隆了，总是离心，吹打这样不会影响细胞的存活吗？再说刚复苏的细胞这样折腾能行吗？我就是想看看大家都是怎么复苏的？
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 11:46

回复 oucflora 的帖子
- \' N8 K; w; |$ _
8 l& \# M0 ~, h% C7 f还有那你们一般DMSO浓度到底用多大啊？
作者: dilal    时间: 2011-9-5 12:15

人的iPS细胞生长本来就很慢，既然有贴壁的细胞，为何不继续培养培养，看能否长起来。我们前一段时间买回来的miPS细胞也出现了这种情况，幸亏细胞收到后我们冻存了5管。传完代以后细胞大量漂浮，而且成团状，下面也有少量的细胞贴壁，换完液第二天同样出现相似情况。见帖子http://www.stemcell8.cn/thread-44333-1-1.html
5 |! R6 K2 N, R2 ~/ d9 t当时怀疑是饲养层被支原体污染了，所以将细胞全扔了，剩下的冻存细胞一直没敢再养。最近一直在拿mESC摸索合适的培养条件。建议楼主暂时停下来，找到原因了再去养，查查是否有支原体污染或其它污染？
作者: Yedan    时间: 2011-9-5 17:27

回复 oucflora 的帖子! y$ o  g$ w1 _. O6 r$ s" B/ k+ I

! Y# J: |, q6 K4 Y4 u您不是说LZ的10%DMSO浓度低了吗，所以我想请问您冻的时候用多少浓度，还有reference是什么。至于DMSO的作用就不用您解释了……
作者: Yedan    时间: 2011-9-5 17:31

回复 rongrong 的帖子3 Q* M8 O: P  ?1 Q5 H

# r/ m3 G$ P: A' C其实一开始我还猜测LZ你养的是小鼠的ips呢……
- e8 C0 P4 P) y* M& B5 i5 B! J你养的是人的ips，为什么会是单细胞？我们实验室都是用针划了传代的，不会消化成单细胞的，再说人的干细胞不能像小鼠那样打成单细胞的，养不活的……- X! e6 i$ }( i. [$ I8 M' D
作者: Yedan    时间: 2011-9-5 17:39

回复 jefferson 的帖子4 }0 u% T, O% m

' r9 C* T( K1 E& I3 g  v/ x应其龙的2i不是用在mES的Feeder-free的culture吗，在复苏的时候有用吗？求reference
作者: 张也行    时间: 2011-9-5 17:52

回复 rongrong 的帖子9 q1 d; d$ |; i: e; x0 n
( E( e  W( m& w
我觉得是因为你复苏时吹打太剧烈造成的。你是高手，应该明白人的ES和iPS传代时都是传的小集落而不是单细胞，吹打的过于剧烈，小集落不容易生存，更何况是复苏的时候呢。
0 N: Z! `1 Y4 i& I# D, ?1 k; O( y' B( d( @
很奇怪你怎么知道贴壁的是单细胞呢？人的ES或iPS细胞单细胞应该很难成活吧，应该是几个细胞形成的小集落吧。
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 18:15

回复 Yedan 的帖子& f8 t! w6 V0 H# @7 h6 z

+ t% u: d1 N) x, N:'(我是用胶原酶消化的，然后复苏时要洗几遍，不断吹洗，离心，反正就成那了，我也不知道，没有吹很多次的
作者: rongrong    时间: 2011-9-5 18:17

回复 张也行 的帖子  b& }( J+ E$ s  r) I
) }5 c5 ~! ^& q$ D. g, Z
恩，算是几个细胞的小集落，但是边缘没有那么明显的界限，估计都不行了，我现在想起要养干细胞手都抖，不知道怎么来呵护它，他就会好好的。。。唉1
作者: 张也行    时间: 2011-9-5 18:19

回复 rongrong 的帖子
3 a5 s- E8 Q8 D% u. \& `3 n# {1 A0 \  N% j, X0 _
做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。
作者: cicadacjk    时间: 2011-9-5 18:49

回复 Yedan 的帖子
# ?( Q; g( e- c" S  E, r- F* e& d- r4 U* A) w3 I7 D( [9 K! @: v. C$ G
这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的
6 D2 c6 t) J- F% h% b" S  d对jefferson就没必要这样了吧4 g  F6 Q) B# i
Y27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。
) i6 ]7 _- A& k9 q5 s7 L) t! W" b至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。
! H0 f) X' ~, o8 {2 l3 w6 i! G7 ]; q) g1 u; n
按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。
作者: oucflora    时间: 2011-9-5 20:25

回复 rongrong 的帖子2 {* ]5 W  C2 ]  X1 M2 u& ]

. `" U3 [% c( r9 C20%,曾经一个师兄用过更高的浓度，大概30%，细胞情况也挺好。
作者: oucflora    时间: 2011-9-5 20:26

回复 rongrong 的帖子
5 c2 j: J6 o) ?6 Q. O. Y9 G, _
/ s, L" |4 V9 \# ]# E在-80度放置两天对细胞成活率影响不大，倒是液氮量特别少，会导致细胞死亡较多。
+ E5 u! n/ E0 V; X2 T! ^0 y% A
. S" N/ M0 y# l- F补充内容 (2011-9-5 20:27):& |7 N, f* v3 s/ }. _) M; O7 }) A
不过如果你们的液氮罐是保温较好的进口的话，影响倒是不大
/ `' x: I8 Q# ~9 S: h/ z" ], r0 ]/ z0 y+ N
补充内容 (2011-9-5 20:28):
5 R' [  U; w! K9 s“进口”的意思是“非国产”
作者: evial    时间: 2011-9-6 08:07

FBS：DMSO=9:1你的浓度低了
作者: rongrong    时间: 2011-9-6 11:11

回复 张也行 的帖子8 \/ k) S9 o- I4 Y

9 K) x6 Z* O6 G- z* G: `3 p恩，好的，谢谢鼓励啊，继续前行再接再厉
作者: jiefengbing    时间: 2011-9-9 15:11

回复 cicadacjk 的帖子
- p4 [4 @, r3 @: W! T) T5 B$ q9 R: L0 f0 x: K4 W
wicell 复苏ES不需要离心？正好我手头上有一份，200g离心5min,然后gently re-suspend cell pellet.不知道您的步骤是哪个版本，可否让我看看？
作者: hnczlw48005    时间: 2011-9-9 16:22

复苏温度应该在37°，冻存干细胞时的血清很重要，最好用进口血清，浓度越高越好，可以用90%FBS+10%DMSO作为冻存液。
作者: yangel    时间: 2011-9-13 15:54

rongrong 发表于 2011-9-4 11:45 ; X! S* u. P: s3 Q& A
大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺 ...

7 d) R( Z0 G( e5 ^. U! l! `0 d; b做的没错！复苏成这个现象也正常，再养几天看看有没有小的ips clusters长出来。要提高复苏效果的话用Y-27632处理24h。



欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/) Powered by Discuz! X1.5