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标题: ips全军覆没，我该怎么办？ [打印本页]

作者: rongrong 时间: 2011-9-4 11:45 标题: ips全军覆没，我该怎么办？

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

作者: oucflora 时间: 2011-9-4 13:05

冻存时DMSO浓度过低；) X7 n3 d5 |$ A* }* d
另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？

作者: evial 时间: 2011-9-4 14:38

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做

作者: Yedan 时间: 2011-9-4 17:21

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' J. p! g4 `& F. @% D6 O+ F) i
10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……

作者: Yedan 时间: 2011-9-4 17:22

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9 S, c# F( O! }
800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？/ e/ G' H0 v; ^5 o% Y' r# c
我们实验室从来都是1200rpm的。。。

补充内容 (2011-9-4 17:27):
另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。

作者: oucflora 时间: 2011-9-4 23:01

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: G& R! H7 h1 O9 K/ B P* c/ a
在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。

作者: jefferson 时间: 2011-9-5 10:18

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了. 对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意: % R% N# A$ X! f7 Q
% b5 H, N5 V/ z
1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.8 \+ \7 }- ?8 v# C0 F1 S6 @
2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作
3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.
4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定. # N( w6 f0 H/ d5 G" `
5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 11:41

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我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 11:42

回复 evial 的帖子1 ~* x! g0 H. ~1 d" s

英文版是啥啊？我是新手，好多东西费了包包但是不能下载啊

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 11:45

回复 Yedan 的帖子* s2 x5 a) M+ F7 b0 ^
) ?6 k6 k' P" l; V3 s+ `1 q
是人的，800转看起来是全部离下来了，我听别人说他们都是静止放5分钟就好，主要我得细胞都变成单细胞了，不再像以前那样一个个克隆了，总是离心，吹打这样不会影响细胞的存活吗？再说刚复苏的细胞这样折腾能行吗？我就是想看看大家都是怎么复苏的？

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 11:46

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还有那你们一般DMSO浓度到底用多大啊？

作者: dilal 时间: 2011-9-5 12:15

人的iPS细胞生长本来就很慢，既然有贴壁的细胞，为何不继续培养培养，看能否长起来。我们前一段时间买回来的miPS细胞也出现了这种情况，幸亏细胞收到后我们冻存了5管。传完代以后细胞大量漂浮，而且成团状，下面也有少量的细胞贴壁，换完液第二天同样出现相似情况。见帖子http://www.stemcell8.cn/thread-44333-1-1.html" F4 N, T. {+ H9 }8 A
当时怀疑是饲养层被支原体污染了，所以将细胞全扔了，剩下的冻存细胞一直没敢再养。最近一直在拿mESC摸索合适的培养条件。建议楼主暂时停下来，找到原因了再去养，查查是否有支原体污染或其它污染？

作者: Yedan 时间: 2011-9-5 17:27

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您不是说LZ的10%DMSO浓度低了吗，所以我想请问您冻的时候用多少浓度，还有reference是什么。至于DMSO的作用就不用您解释了……

作者: Yedan 时间: 2011-9-5 17:31

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2 W+ t/ ~; J+ D2 S/ i r* d0 A
其实一开始我还猜测LZ你养的是小鼠的ips呢……: v3 h' W% S& H7 |8 k( b
你养的是人的ips，为什么会是单细胞？我们实验室都是用针划了传代的，不会消化成单细胞的，再说人的干细胞不能像小鼠那样打成单细胞的，养不活的……

作者: Yedan 时间: 2011-9-5 17:39

回复 jefferson 的帖子6 G" g6 P& [' S' ?. t* ]- T3 U' ~

应其龙的2i不是用在mES的Feeder-free的culture吗，在复苏的时候有用吗？求reference

作者: 张也行 时间: 2011-9-5 17:52

回复 rongrong 的帖子0 K! g' ^) }& S' G; A" a

我觉得是因为你复苏时吹打太剧烈造成的。你是高手，应该明白人的ES和iPS传代时都是传的小集落而不是单细胞，吹打的过于剧烈，小集落不容易生存，更何况是复苏的时候呢。

很奇怪你怎么知道贴壁的是单细胞呢？人的ES或iPS细胞单细胞应该很难成活吧，应该是几个细胞形成的小集落吧。

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 18:15

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:'(我是用胶原酶消化的，然后复苏时要洗几遍，不断吹洗，离心，反正就成那了，我也不知道，没有吹很多次的

作者: rongrong 时间: 2011-9-5 18:17

回复张也行的帖子" H, i+ A$ Z5 ?) B4 |' K9 l& G( `

恩，算是几个细胞的小集落，但是边缘没有那么明显的界限，估计都不行了，我现在想起要养干细胞手都抖，不知道怎么来呵护它，他就会好好的。。。唉1

作者: 张也行 时间: 2011-9-5 18:19

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做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。

作者: cicadacjk 时间: 2011-9-5 18:49

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这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的
对jefferson就没必要这样了吧
Y27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。
至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。. Y" |( [3 K* E/ ]- i: s, R; @
4 m& | W+ p4 s6 Z3 C4 _4 ~
按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。

作者: oucflora 时间: 2011-9-5 20:25

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- G" H, x& G0 \3 O
20%,曾经一个师兄用过更高的浓度，大概30%，细胞情况也挺好。

作者: oucflora 时间: 2011-9-5 20:26

回复 rongrong 的帖子+ A- E5 ~5 {2 P6 k! @+ `% X5 l5 p

在-80度放置两天对细胞成活率影响不大，倒是液氮量特别少，会导致细胞死亡较多。8 {* A: m+ M3 H) M, h3 b
& u b) w4 @: Z' z, v
补充内容 (2011-9-5 20:27):
不过如果你们的液氮罐是保温较好的进口的话，影响倒是不大

补充内容 (2011-9-5 20:28):1 a+ h- ]$ o5 O3 B2 [. R
“进口”的意思是“非国产”

作者: evial 时间: 2011-9-6 08:07

FBS：DMSO=9:1你的浓度低了

作者: rongrong 时间: 2011-9-6 11:11

回复张也行的帖子& a# O- M- d5 U* C2 ]& g
, u% h( i1 M5 X/ Y3 u. S+ c" o( r
恩，好的，谢谢鼓励啊，继续前行再接再厉

作者: jiefengbing 时间: 2011-9-9 15:11

回复 cicadacjk 的帖子9 @) J5 n: O/ B) P: i

wicell 复苏ES不需要离心？正好我手头上有一份，200g离心5min,然后gently re-suspend cell pellet.不知道您的步骤是哪个版本，可否让我看看？

作者: hnczlw48005 时间: 2011-9-9 16:22

复苏温度应该在37°，冻存干细胞时的血清很重要，最好用进口血清，浓度越高越好，可以用90%FBS+10%DMSO作为冻存液。

作者: yangel 时间: 2011-9-13 15:54

rongrong 发表于 2011-9-4 11:45
, _+ r- x3 ]$ {" A大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺 ...

7 Z$ g O. z/ r r4 T+ d
做的没错！复苏成这个现象也正常，再养几天看看有没有小的ips clusters长出来。要提高复苏效果的话用Y-27632处理24h。

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