为什么小鼠胚胎干细胞培养过程中成团漂浮？

dilal

最近一段时间，mESC培养过程中多次出现细胞成团的漂浮现象。我用的是CGR8系的小鼠胚胎干细胞，饲养层是自己原代提取的MEF（昆明小鼠孕鼠），培养基成分为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇，培养时加入1000U/ml 的LIF。起初怀疑是饲养层的问题，所以采用了无饲养层培养方法（明胶铺板）。把复苏的细胞分成三瓶，一瓶feeder+KSR培养基；一瓶feeder-free+KSR培养基；一瓶feeder-free+FBS培养基（80%knockout DMEM+20%FBS（Gibco）+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇）。
; J# `9 D  ^& U* M+ S2 n复苏后第一天：feeder+KSR培养基：mESC贴壁可，漂浮细胞较少，10倍镜下可见很小的细胞集落，细胞状态可；
- `# _6 x9 u0 @5 A( ?              feeder-free+KSR培养基：mESC贴壁差，漂浮细胞较多，贴壁的细胞多呈圆形，折光性差，感觉细胞缺乏活性；
) P( K+ u+ A% P+ E( R/ j$ I              feeder-free+FBS培养基：mESC贴壁好，漂浮细胞不多，细胞集落较大，贴壁的细胞呈圆形、条形，许多细胞出现了分叉（感觉有所分化）。
, {# D* \% b! d复苏后第三天：feeder+KSR培养基：mESC出现大量漂浮细胞，漂浮细胞成团（偏黄），贴壁的细胞集落生长缓慢，而且边缘界限不清，feeder状态也欠佳，高倍镜下可见许多的黑色颗粒；
: I0 Q2 e6 u6 Q6 D              feeder-free+KSR培养基：mESC同样出现大量成团漂浮的细胞，贴壁的细胞多呈圆形，未见生长，折光性差，细胞状态很差；
* F- ]5 R3 h9 G) w, A              feeder-free+FBS培养基：mESC漂浮细胞不多，细胞集落明显增大，分叉的细胞集落明显增加，分化比较严重，但未见有成团漂浮的细胞。
7 P% d6 R0 N. \2 [: Z+ i7 I5 S不禁产生以下疑问：1、为啥KSR培养基培养的mESC在复苏第三天都出现细胞成团漂浮的现象？是否跟KSR有关？* z  ^. L, ~* h. N6 J$ r' m: Y
                  2、FBS培养基培养的mESC贴壁是否明显好于KSR培养基？为啥KSR培养基下几乎没有存活的细胞？+ I1 ]0 Q) r7 t8 ?$ q- O1 y
                  3、MEF是否存在支原体污染的情况？/ O+ R* @6 q" U$ W/ Z* a
                  4、我们复苏的mESC以前是用FBS培养的，是否是因为突然更换为KSR培养基，mESC不适应？" O" {. \+ i/ H! _/ H
补充一下，我们用feeder+KSR培养基培养从广州生物研究所买来的miPS细胞时，也同样出现了细胞成团漂浮的情况，由于细胞来之不易，所以已经终止了iPS的培养。我们所采用的KSR培养基配方是广州生物医药与健康研究院提供的，KSR也是专门用于ES和iPS培养的。找的指定代理商买的，也不知道是不是KSR有问题。最近一直很迷惑，不知道下一步该如何是好。求高手指点，细胞养不好真的是耗时有耗力。

第七舰队

你在传代的时候，用的多大浓度的胰酶？消化多长时间?
. s' d" n0 g6 d' X  a, Z' S9 E

dilal

回复 第七舰队 的帖子7 h. b/ ~+ h3 i- ^* s

- m& g. ~7 \1 y, l$ I0.25%胰酶，消化了2-3min

christophe

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9 J, [8 c6 E' ?4 M0 i$ y- e- x) X8 z. e9 g" C4 c% I/ v
CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些，边缘也不如feeder上清晰，这都正常。
# ]- ~1 D& B1 S5 u$ u* R我们是用高糖DMEM+15%FBS+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-ME+1%P/S+LIF.2 z1 @* T; X% e; ]2 g
既然无feeder没问题何必要用feeder，还干扰实验结果；
4 ?3 x5 V" p9 R既然FBS就很好，何必要用KSR呢。

sapery279

虽然没有养过CGR8这种mES，但是KSR培养基在支持细胞贴壁（无论有无feeder）和促进细胞生长方面是比不上FBS，如果楼主用的FBS质量比较好，不会导致细胞分化的话，用FBS养还是不错的，如果会导致分化，最好还是在用FBS复苏或是传代过细胞之后，换成KSR培养基。另外feeder-free的情况下，FBS和KSR都会使克隆平铺下来生长，感觉状态不是很好。

luwei8157

christophe 发表于 2011-8-5 14:20
. V* I1 x3 X) n+ Z5 h* ?/ b6 r. ]+ k回复 dilal 的帖子
5 d6 N. F% T" R7 w$ E/ g4 J; ?% v& G$ [) h- ~" B" {
CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些， ...

( Z% ]8 h3 O/ F, x同意。我们也是同样的方法，而且你买细胞的地方，也是用这样的方法：）

dilal

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9 O0 A( ?. m0 r  ^3 L/ H2 s8 S. Z6 f& G4 x$ j
谢谢你的建议，我们用的是Gibco南美的血清，没有经过ESC培养筛选，感觉细胞状态比较差，细胞集落周边有分支及分叉，不像我们以前养的细胞集落一样形态比较规则，圆圆的，鼓鼓的，镜下看起来集落很均匀。怀疑可能是血清的原因引起细胞分化，所以才改为用KSR（专用于ESC培养）。不知道你用的FBS具体是什么，能否透露一下？

dilal

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; x; [$ N1 @2 ^4 W. u' P! @3 k* h; [2 {
的确是，我们培养了一段时间也发现KSR培养的ESC贴壁性较FBS差一些。你说的先用FBS培养再改为KSR培养，确实是一个好方法，我们将尝试一下。

dilal

问题已经得以解决了。在此向大家汇报一下：
' V/ r$ t2 t, `' e. j) [+ Y我尝试了一下用广州生物医药与健康研究院寄细胞时多余的培养基（KSR）来培养ESC，培养前我先加入了一定比例的1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇（因为培养基放置超过了半个月），重新复苏了一瓶细胞，接种到无feeder明胶铺板的培养瓶中。复苏后第二天观察：大部分细胞都贴壁了，已有细胞集落形成，集落扁平，有些细胞周围有分枝。未出现前一批KSR培养基细胞成团漂浮的情况。. \* N* S( F& R
重新复苏了一管MEF（P1代）：复苏后细胞存活率不到10%，大量的细胞漂浮，细胞状态差。换液培养2天后发现：细胞生长缓慢，镜下细胞显得很薄，细胞核内可见黑色的颗粒状物质，细胞质中可见许多聚集的亮点状物质，遮光性强，细胞膜上粘附有圆状亮点。2 Q# h1 x/ `7 {# w7 W' S( i4 D3 E
重新配制KSR培养基，从而确定是否是血清替代物出现了问题。配制方法为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇。用该培养基培养传代后的mESC，与广州的培养基进行平行对比。今天观察细胞发现：细胞贴壁可，漂浮细胞较少，未见成团漂浮的细胞。细胞状态留待进一步观察。3 b0 ^/ c) H, B2 O' p5 X
目前推断：1、原先的KSR培养基可能存在污染，但单独将培养基放到孵箱里未见有污染迹象，怀疑存在支原体污染。
6 j' D: b& \0 ~; y9 V& r4 |          2、原代提取的MEF可能存在支原体污染。依据：冻存细胞复苏效果差，复苏后的细胞显微镜观察结果像是MEF污染。
# m* B  E7 ]' z9 }+ Y          3、KSR培养基污染可能来源于MEF，血清替代物本身未见污染（还需继续观察）。; k6 f) `/ {3 J  a6 Y) h+ o
由于实验室尚没有支原体相关的检测手段，上述推断也没法证实。下一步准备重新提取MEF，扔掉所有冻存的MEF和可能存在的培养液。看来正规的实验室培养程序还是很重要，如果当初我们对原代提取的MEF进行了支原体等相关检测，就不会耽误这么长时间。
: O2 r/ I2 O) n- P- ?: i希望我们的教训能给大家一些帮助，如果大家有什么好的建议或者有价值的教训，以及自己实验室细胞培养过程比较完善的检测方法或者不足之处，可以借这个帖子共享一下。欢迎大家畅所欲言。

christophe

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: T6 ]9 l" O" A% V3 p2 [7 T& ]" S
我们用的是Millipore 的for ES 的FBS。/ A+ F9 ^% C# g3 o% r4 `
需要注意的是KSR在四度的保存期很短。
4 U  a* v5 W1 \3 y, y& Q. c7 R另外，你KSR的污染来源怎么会是MEF呢？