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标题: iPS分化了吗？ [打印本页]

作者: 573639471 时间: 2012-3-14 09:07 标题: iPS分化了吗？

之前发帖! j3 ^) m6 H: p" g9 X
hiPSC克隆周围的细胞也是iPS吗？
http://www.stemcell8.cn/thread-53304-1-1.html
多人说我的iPS已分化了，心急啊
3 A, S5 w9 H6 d7 g r( O o
我原先是feeder培养，现在换培养基了，feeder-free培养，转换后约6天的图片如图

作者: 573639471 时间: 2012-3-14 20:28

[attach]39956[/attach][attach]39955[/attach][attach]39954[/attach][attach]39953[/attach]

作者: 白巧克力 时间: 2012-3-14 22:31

看样是的啊，但我没用过free的medium。
ps 图好漂亮...

作者: 573639471 时间: 2012-3-15 08:27

回复白巧克力的帖子 ] w v, N0 v& ~% A

到底是漂亮还是分化了啊给点具体的分析和建议嘛, m" B. L4 ^7 T v; E; \

作者: song58 时间: 2012-3-15 16:17

回复 573639471 的帖子2 _ F7 ?( O' ]. U
* H/ h+ C4 i3 b( A$ ]8 M
克隆也太多了吧，该传代了。传完估计会好一点。现在看上去我觉得真不是太好看...# {9 X) _3 Z8 L) E; Q+ g: A
& K$ m% O8 P1 A9 j* W
补充内容 (2012-3-15 16:19):
另外，我个人建议挑克隆传代。有好多分化的细胞，用酶消化后传的话还是会影响新一批的实验结果

作者: 573639471 时间: 2012-3-15 18:07

回复 song58 的帖子# ]# {' x" k% Y3 `# t7 J

纯粹的机械挑，岂不是很费事啊，一个六孔板的孔就得挑几十个克隆吧。关键是我经验少，真不太确定哪些克隆就是非常好的、未分化的克隆

作者: song58 时间: 2012-3-16 10:08

回复 573639471 的帖子& R4 @! e, j' e* J/ E0 _- q& b

不知道你这些细胞还是否依然健在...
要是我的话，我可能会挑如图所示的克隆7 h- V& `, W& N# }

作者: song58 时间: 2012-3-16 10:17

回复 song58 的帖子

我靠，图片在哪里？[attach]40012[/attach]

作者: song58 时间: 2012-3-16 10:18

回复 song58 的帖子

那个PDF是我第一次上传图片未遂想存成pdf上传的文件，大家没必要看了，和这个图片一样的内容

作者: 573639471 时间: 2012-3-16 11:17

回复 song58 的帖子: z3 n* b& X% `7 w+ n+ T* }4 w
P, g; o) F6 K8 b3 x
非常感谢啊不过今天细胞[attach]40020[/attach][attach]40019[/attach][attach]40018[/attach]全污染了。剩下一些克隆，不知还能挺多久。有2个孔的克隆中间是小黑圆圈，这是什么分化啊？

作者: mohanmud 时间: 2012-3-17 06:29

楼主细胞种的太密了，克隆周围的可以看出明显长条形的细胞是分化的细胞，挑的时候注意剔除这些分化的细胞

作者: song58 时间: 2012-3-19 09:41

回复 573639471 的帖子

是分化的挺严重的...2 j/ v% v/ g& P5 ^ L
小黑圆圈？看不懂，也看不明白是什么分化方向..." P8 O- Y2 W# r1 ^- P- h* q% D( K
LZ好运！

作者: wangyimei 时间: 2012-3-19 13:38

细胞状态不好啊，是人的iPS细胞吧，形态不好，细胞克隆不紧致，呈颗粒感啊

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:10

回复 573639471 的帖子

克隆数量过多，一般情况下T75 Flask中的克隆控制在30~50最好，而且每次传代前应将分化的克隆剔除。你图片中基本上所有克隆的周边都分化了。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:15

回复 573639471 的帖子; l1 k% p, a9 ]; k6 Z8 {
! x& E: `1 R8 U6 M
这是我刚买回来时候的克隆形态，整个T25中就不到10个克隆。你中间的小黑点是因为细胞密度过密。也是要去除的

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:17

回复 ligangtiancai 的帖子% ~# N( w. N) c: w4 k

[attach]40503[/attach]忘上图了

作者: dilal 时间: 2012-5-3 16:51

很明显是分化了，细胞集落和集落之间已经融合了，而且集落边缘出现了上皮样的细胞形态。细胞生长时间太长或者传代密度过大的原因，集落中间已经发黑，并出现空洞现象。建议弃掉

作者: xiphias 时间: 2012-5-3 17:16

我觉得分化的很厉害啊。。) I! A' I4 A! |: k0 M2 H1 j4 i, Y2 ~
你做个qPCR 看看oct4 还有分化marker吧。

作者: 573639471 时间: 2012-5-3 22:07

回复 xiphias 的帖子

OCT4 只要表达就可以吗，是不是只有内源的表达才可以

作者: xiphias 时间: 2012-5-3 23:29

回复 573639471 的帖子

当然有一定倍数。500-2000倍吧。内源的。有时候外源基因会不沉默。我觉得你养的这些克隆都不太好呢。

作者: pjlsyz 时间: 2012-5-4 09:29

还没到这一步呢。。。看看图片也好。。。

作者: wangyimei 时间: 2012-8-19 09:05

细胞状态感觉不是很好，是刚诱导出来的ips细胞吗，和ES细胞形态不太像啊

作者: 573639471 时间: 2012-8-20 10:07

回复 wangyimei 的帖子6 U6 ?1 n' |8 ^2 e0 ~

不是自己诱导的，直接买来的

作者: w1986725 时间: 2012-8-21 16:30

貌似是向皮层细胞分化了，个人建议你如此分化的细胞就不要了，下次传代的时候注意消化的时间以及吹打的程度，祝好运！

作者: 也行天下 时间: 2012-8-21 16:57

回复 ligangtiancai 的帖子

这个克隆的细胞也像是已经分化了吧！hiPS细胞应该是圆形紧密排列的吧，细胞之间如果看到比较亮的条带，就是开始分化了吧。

作者: 也行天下 时间: 2012-8-21 17:06

回复 573639471 的帖子$ A; U' A) Z. w7 O7 b2 T4 i f
9 Y) ~5 e$ L( K% W/ W
周边大多细胞都已经分化了，中间的细胞感觉也不太好，都重叠起来了，是不是传代时克隆太大了？
如果不是新复苏的细胞，传代前细胞形态还很好的话，分化如此严重我觉得是不是培养基的问题啊？你feeder-free培养用的什么培养基啊？

作者: linda9958 时间: 2012-8-23 17:22

楼上说的污染是这些小点点么？我有时候养细胞也能看到，不过培养基没有变色或者浑浊，我一直以为是细胞碎片，不知道楼主说的污染，指的是细节污染还是别的什么污染了？

作者: sanna1 时间: 2012-8-23 22:20

中间这个黑圈时分化的细胞吗？

作者: smallbite 时间: 2012-8-24 03:11

下面的图不好，上面的可以。细胞太密了。

作者: frankieisme 时间: 2012-8-24 05:07

第一张图中还有一些好一点的细胞,到后面,尤其是用红圈圈起来的克隆100%已经分化了.

作者: 也行天下 时间: 2012-8-24 08:06

回复 frankieisme 的帖子
* H0 @! [7 b4 D: F- V' w1 x
我觉得红圈圈起来的是传代时克隆太大了出现的结块现象吧，周边的倒像是分化了的。不知道对不对。我在进行iPS细胞传代时如果克隆太大就会出现克隆中间呈棕色现象。

作者: katysong 时间: 2012-8-24 08:11

回复 573639471 的帖子0 S* e" {. \7 n$ Q: `  k! o

培养干细胞很多时候都要用机械法传代的，挑取好的克隆或是把已分化的克隆刮掉，有几种比较典型的分化情况分享一下：
1. 克隆团中间塌陷，形成“孔状”，中间即为分化的细胞；  t8 q0 S$ {+ m4 f1 N4 r
2. 网状结构，不够致密，可能来源于已分化的干细胞或是上次传代残留的Feeder；1 O  P; {. K& M/ X/ g) G: Q
3. 有中间隆起的发黑的细胞团应该是已经分化并死亡的细胞（个人感觉楼主的细胞有这种情况，应该之前就应该传代的，时间稍微晚了一点）；2 x2 T+ B$ Z$ v/ p$ ~
4. 还有一些克隆状态不好的，边缘会比较“混乱”，中间细胞形态也不均一，也应该舍弃；
或许有不对的地方，希望对您的实验有所帮助……

作者: sunny2829 时间: 2012-8-24 09:33

回复 573639471 的帖子$ P3 S! w ` x) F
- u) ~: y0 T7 t2 R1 P8 R
个人认为那是未完全重编程的克隆，多层细胞，边缘细胞为不规则多边形，形态上与典型的ES克隆差别挺大的。

作者: wangyimei 时间: 2012-8-24 11:39

回复 573639471 的帖子2 `. I! c+ s+ p3 X0 T; y! s

啊，这样啊，状态看着不是很好啊，看看从哪买来的，找他们的人问问看

作者: dianying 时间: 2012-8-24 12:30

回复 573639471 的帖子

你确定是黑孔吗？如果是上面的一层膜，你可以试着拿针剥离开，看看底下的要是没分化，就还可以把它传代。

作者: murry 时间: 2012-8-25 17:11

周围已经分化了。污染了的细胞应该立刻马上处理掉！再放在培养箱内，或者打开盖子的话，很可能会把细胞房的环境污染掉！那就杯具了！

作者: Jonathan 时间: 2012-8-30 10:44

回复 song58 的帖子
' i. }- T# E8 R7 D r9 x0 J u) g
你不要在这里误导他了。你画圈的这些克隆，没有一个好的。应该说，LZ的图片里面，没有好的克隆。基本都分化了。如果是我，就扔了。重新做。

作者: lchanlon 时间: 2012-9-22 10:02

你是不是加了ROCK inhibitor啊，如果没加的话应该是分化了。

作者: 573639471 时间: 2012-10-8 18:47

回复 lchanlon 的帖子/ w) Y0 A/ p) u5 P
1 n6 W* w2 a: Y8 H, ?* S, b. D
加了

作者: 荣荣荣 时间: 2012-10-14 09:57

我以前机械法将细胞挑出来的时候，就是这个样子，过一段时间就展开了，即使不展开又用胰酶消化继续传代就好了。

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