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标题: 再发图！用Ficoll分离脐血后的效果（15ml和50ml离心管） [打印本页]
作者: huajie881026    时间: 2012-8-2 10:38     标题: 再发图！用Ficoll分离脐血后的效果（15ml和50ml离心管）

前不久，做脐血MSC分离，用50ml离心管分离后，白膜层不清晰，故发了一帖http://www.stemcell8.cn/thread-58525-1-1.html+ Z6 U$ V2 f/ y' X
昨日又做了一次，分别用50ml和15ml离心管都做了，还是按Ficoll说明书来，500g  20℃  30分钟，结果50ml管还是“白雾”层，15ml就是大家所谓的“白膜”层（下图），可见是离心管的不同导致了分离后分层的区别。+ n1 d/ m8 X8 V9 T9 S8 |7 F4 E
可问题又来了，我100ml脐血，用100mlPBS稀释，再用100mlFicoll分离，这得要20个15ml离心管来分离啊，这得多浪费啊。不管怎么样，我还是用50ml的离心管先做了，我相信能得到MSC！！！( L0 K4 E5 y" z$ [, S/ n. ?9 x
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作者: 帝国黑骑士    时间: 2012-8-2 10:43

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: M0 {6 R; r) O, U1 I3 {我觉的 用50ml 的离心管离心是的离心力可以再大一点，可能会好一些！比如700g ！个人觉得。
作者: lm310389487    时间: 2012-8-2 10:48

经验：离心力稍微调大些效果更好，大概就700g吧
作者: huajie881026    时间: 2012-8-2 11:04

嗯  下次我再改进，用700g以上再试试。
/ a0 q5 n% Q! u: j, t我一直用500g，30min，一方面是Ficoll说明书上这么说，一方面是下面一篇文献上也是这么做的
6 r/ b- D& G3 [1 f他做了四百多分脐血，最后发现＞90ml脐血和2小时内操作是成功的关键
/ H8 m* H. p9 Z9 e[attach]44698[/attach]
作者: xuehu20    时间: 2012-8-2 14:48

回复 huajie881026 的帖子3 P& ~, \/ Z: ^5 |

7 s/ B- F& a1 S; I% _你好，请问你说的文献有原文吗，能给我一份吗，谢谢
作者: sdwzg119    时间: 2012-8-2 14:56

Ficoll是国产的还是进口的？？我对比过国产淋巴细胞分离液和进口的之间的区别，进口的明显比国产的好的多！！粗略算算，大约进口的能比国产的得到多50%的细胞
作者: huajie881026    时间: 2012-8-2 16:27

sdwzg119 发表于 2012-8-2 14:56
8 O; e+ h) ~# g* E0 [8 aFicoll是国产的还是进口的？？我对比过国产淋巴细胞分离液和进口的之间的区别，进口的明显比国产的好的多！ ...
( N( n. ?; |, F2 j! M( \
进口的，GE的，2000+才600ml，分一次要用100ml，所以分一次心疼啊
作者: huajie881026    时间: 2012-8-2 16:28

xuehu20 发表于 2012-8-2 14:48 , u1 @! g1 T5 n! S: ^9 P
回复 huajie881026 的帖子
5 h5 G) E+ R6 w8 V; W9 J) X& G& D5 s9 q9 @8 D8 K: J  O4 `& o" p
你好，请问你说的文献有原文吗，能给我一份吗，谢谢
- L$ V, v! g: [4 ^6 a
此贴可下载
' G: [% z( ?( z7 C7 c# I  Ehttp://www.stemcell8.cn/thread-58705-1-1.html
作者: 542177563    时间: 2012-8-6 21:28

回复 huajie881026 的帖子
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3 [) u3 L; Y  N$ a9 E0 T' P  Y学习中
作者: 透明之蓝    时间: 2012-8-7 16:41

本帖最后由 透明之蓝 于 2012-8-7 16:42 编辑
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huajie881026 发表于 2012-8-2 10:38
1 ~" @9 O/ t  g' S" M$ I, N前不久，做脐血MSC分离，用50ml离心管分离后，白膜层不清晰，故发了一帖http://www.stemcell8.cn/thread-58 ...
1 Y; _' [$ {0 C7 u% c, E

6 @% o2 ]8 t0 m$ e8 j, a, m7 @同样的分离液，15cm的肯定分离效果更好。7 r/ y) @) `; v8 P$ t
肯花2000元买分离液，看来你是在搞科研，而且，脐血的MSC含量少不好养出来，综合你的情况，还是用15cm的吧！: H3 r% j/ a$ u/ j

, e$ n- d; |, _# Z1 c/ |By the way：养出来了通知一下，呵呵，我曾养过几次，情况都不好！祝好运！
作者: pailishi    时间: 2012-8-7 17:13

我跟你一样分的，但是我用EGM-2要养的是EPC ，最可恨的是经常被MSC克隆污染，而且这个MSC克隆增殖奇快无比，头痛！！！
作者: huajie881026    时间: 2012-8-7 17:35

pailishi 发表于 2012-8-7 17:13 1 f! L3 G+ x) W/ U' d
我跟你一样分的，但是我用EGM-2要养的是EPC ，最可恨的是经常被MSC克隆污染，而且这个MSC克隆增殖奇快无比， ...
2 X1 V5 E3 s6 C7 A* V8 P
MSC在EGM-2里养的活？其实应该养的活，只要血清好。6 |8 t# y7 {5 `' ]  `
你养EPC可以试试脐带的或者外周血的嘛！那样被MSC污染会低一点！
- V9 U. t1 Q7 _. X# ^哦  对了  你用的EGM-2里加什么生长因子吗？血清用的啥牌子的？我以后可能会要养EPC2 j' [4 J" B2 a* t" O2 f( W( \" z$ b
请教了！
作者: pailishi    时间: 2012-8-8 09:03

EGM-2用的就是商品化的成品，相关因子和血清都是配套好了的哦
- ^# J- G' c" B脐带里面的指的是脐静脉内皮细胞吗？外周血EPC含量太低，很难养出来
作者: huajie881026    时间: 2012-8-8 10:16

pailishi 发表于 2012-8-8 09:03 3 B0 @% O; B4 P* V: W9 f
EGM-2用的就是商品化的成品，相关因子和血清都是配套好了的哦
4 r4 X# o+ F  j! c9 ?- o' R脐带里面的指的是脐静脉内皮细胞吗？外周血E ...
$ w; P3 O: j' Z( x3 Z. i
嗯，就是指脐静脉血管内皮祖细胞。外周血的EPC含量的确比较低，不过我印象中看到一篇奥地利的文献是关于外周血大量扩增EPC的，现在一时找不到了。。。
作者: pailishi    时间: 2012-8-8 10:43

呵呵，我们还是想要脐血EPC，主要是MSC克隆污染的问题，其他还好，不过有点觉得EGM-2的质量不稳定
作者: pailishi    时间: 2012-8-8 10:45

有一个带视频的关于外周血大量扩增EPC的文章吧，有点难度
作者: huajie881026    时间: 2012-8-8 11:15

pailishi 发表于 2012-8-8 10:45 # d: O( F# \" D
有一个带视频的关于外周血大量扩增EPC的文章吧，有点难度
! c' x3 y2 T& t0 n9 y
刚搜了下JOVE，看了那个视频，震惊了，最后她用的扩增细胞的培养容器也太大了点了吧！不过她说成功率有50%-70%，只是主要取决于供体血中有无EPC。
2 v: e* z" E/ w! g/ R/ u& \以后如果我也要养EPC，还望你指点啊！
作者: vanessa    时间: 2012-8-8 16:37

你用的Ficoll也太多了吧。我们一般稀释过的血：Ficoll=2：1.我觉得操作的时候注意缓慢将稀释后的血细胞加入到Ficoll中。加入之后尽快的离心，离心的时候升速和降速都慢点，应该会好点
作者: huajie881026    时间: 2012-8-8 21:13

vanessa 发表于 2012-8-8 16:37
# X: t* R# S5 R5 h  D6 C你用的Ficoll也太多了吧。我们一般稀释过的血：Ficoll=2：1.我觉得操作的时候注意缓慢将稀释后的血细胞加入 ...

& }7 @; Y( I' w& o# F8 g. v因为说明书和论坛里都是这么做的，我也想省点ficoll，以后我就按你的比例吧。。。
作者: huajie881026    时间: 2012-8-13 18:16

透明之蓝 发表于 2012-8-7 16:41 # r& {% r% ~  j
同样的分离液，15cm的肯定分离效果更好。
+ r3 ]/ N, L  _  x  J! f3 e. B$ d肯花2000元买分离液，看来你是在搞科研，而且，脐血的MSC含量 ...
( Y( g. U" H! \+ B6 S$ d
出来了一点梭型细胞（有待鉴定），但是杂细胞很多. o9 G9 h$ o9 @" [; t8 M! o
http://www.stemcell8.cn/thread-59259-1-1.html
作者: qiugt0819    时间: 2012-8-22 08:57

我最近也在用ficoll液分离minipig的骨髓间充质干细胞，目前也遇到了分层不清晰的情况，还在摸索中~
作者: fenglinzhu    时间: 2012-8-22 16:36

当然是用15ml的离心管效果好啊。但是之前我也看到人家分离外周血免疫细胞的时候用50ml的离心管分离的，他们好像稀释倍数蛮高的，而且他们好像只装40ml吧。500g离心30min，减速度调到0，效果比你的好多了的。你的分离效果不好可能就是你稀释倍数太少的原因吧，浓度过高的话分离效果肯定不行的。我之前做的是间充质干细胞的分离，也是稀释很多倍的，但我们用的是percoll,15ml离心管，离心20min，效果很好。
作者: cjsbaicai    时间: 2012-8-23 09:20

我觉得15ml效果好就用15ml的，50ml做了，到时候纯度等其他不确定因素会影响你后续试验，那也挺不值的
作者: qiugt0819    时间: 2012-8-24 09:15

想问一下楼主白膜层是刻度7cm和8cm之间有点带红那部分吗？？？
作者: huajie881026    时间: 2012-8-24 09:53

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5 [; b; |* J; N2 @1 V3 C- |$ a; ]& i是的，红色的点可能是血小板，因为血小板也在血清与ficoll之间！
作者: huajie881026    时间: 2012-8-25 00:05

回复 透明之蓝 的帖子
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hUCB-MSCs（如下图）
: k- J, i' [: q2 y[attach]45393[/attach]" ]- z9 M) d+ ~5 c, s9 a
养了四份脐血就成功这么一次！
作者: ditiger    时间: 2012-8-25 22:23

可以试一下先甲基纤维素沉降，再ficoll离心，效果会好很多~~
作者: crazytime    时间: 2012-8-25 23:54

不同脐带血的差异很大，这份脐带血的分离后，红细胞层有点厚了，可以试着多加一点PBS
作者: 透明之蓝    时间: 2012-9-7 10:18

回复 huajie881026 的帖子7 [' A' z$ s0 x* Z

( n, @4 U, ?/ M. A, r  u( j9 X恭喜！！！



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