脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。& z4 X% W$ M9 ]0 I8 s; Y* z
到底什么原因呢？？？ ! u! F* z" n% A1 S1 C

; p( T3 L2 M1 z4 g附上Ficoll说明书: A/ b/ K* J" Z

pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11 + E4 k& b$ z3 v& B# q
这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

# O! b5 j# m3 a哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
" }. a' }. `0 G0 `% `- g2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序; L! `) W: X2 _% |9 r  c0 G- F
3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合/ t2 n* J- m: n. ~* e( V5 o; r
4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动
! n" e3 e9 X* [5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56 2 r  C' i8 c9 R$ q
1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
8 m! m  ~+ b4 ]7 }4 H2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序0 _: Q! @; l" f- m! ]6 ]7 i
3.细胞悬 ...

) C" ~! v5 F  J& D
1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm' ^; `9 `3 r: b# _# Y$ M& T0 c( {
2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度3 |% Y! `2 }* J& O: |3 ~, J& g
3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了
/ [+ L& E! V+ ~: Z4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？
2 E1 c. G+ Y- e3 s, x) d5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC
' O' X% ~! K4 V2 Q; X" z% S, y! A+ G, Z- {
请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？7 \5 U" ]  ~# y0 i- X9 r

" q3 O/ C  [3 f; Y+ @还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47
, V& t9 d; J/ M% d你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

* _3 t) a2 \$ W' G$ H  P是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。8 B7 V1 b; v+ G+ q$ D6 A1 }4 i
他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？7 A3 Z3 ~2 j& r' D
肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题' T% E8 M! Z% Z( Q, F# ?
1.血液是否稀释，比例多少？
, E3 P) s5 _% A+ B3 j2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min1 B% E/ D8 G9 V8 h- }
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。
' }- W3 f9 L- m- k" F- S+ n肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23
" o, P+ _+ K4 V+ [  ]目测有两个个问题
. T( o& W' V. B. Q7 s2 A  J/ ^1.血液是否稀释，比例多少？5 k$ ?9 V. Z" f+ F! ]
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

9 V0 O& D+ c6 l- I
1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的/ w) ^  w# Z" B! K' O9 U/ i
2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。