脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

ly200101042 发表于 2012-7-24 15:37 8 ^$ o3 L; E0 K  A
我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min% P/ R2 |8 v! n% a5 ]7 z7 J# z- q6 `
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例， ...

! L& ^+ ^$ G& R: Q  E: f关于离心时间我一开始是20分钟，可是出现这种情况后，我查了Ficoll的说明书说要30-40分钟，可是出来的结果还是一样，我就很困惑了。。。
9 W3 x% Z9 x1 `血液是等比PBS稀释的，Ficoll与稀释后的血液体积比是1：2

crazytime

你试试将血液离心后，去除学清，用盐水稀释下，另外分离液离心时速度升降一定要调到最慢，基本上就是自然降速
+ ^2 r) h, y* f+ j0 h5 k% }" S$ i( ^( }

huajie881026

crazytime 发表于 2012-7-24 16:24
7 d4 I; D! G& _( A: r1 \. v( x7 Z你试试将血液离心后，去除学清，用盐水稀释下，另外分离液离心时速度升降一定要调到最慢，基本上就是自然降 ...

! Y9 B# f  a8 q. k& J/ n
嗯  我下次尝试一下这个方法。; m6 O; u$ l. z: |) Z6 h% \
离心时速度升降我都调到最慢了。。。

meixue1130

根据说明书上建议的离心力附近，多设几个离心力试试，找到最适合自己实验室的离心机分离的离心力。同样的方法，不同的型号，不同牌子的离心机分离效果有很大的差别，所以得多做几次实验找到最适合自己使用离心机的最适条件。

happyending

离心力500g太小了

wangzhiqi86

回复 huajie881026 的帖子
( d' g8 A9 e2 h& z* j- s# ?' z* g; l: e9 J9 b
我做的是骨髓的，和脐带血的可能还不一样。% e2 W2 Z! ~) O7 o
我之前也尝试用肝素来防凝血，但没用，最后索性直接用PBS去冲骨髓了。) p9 i# [' s  N9 J
个人觉得是转速不够，该离的没有离下去，我用的实验室的分血程序，2790rpm，它们是用来分造血干细胞的，也有有文献报道是3000rpm，你不妨一试。

神经干

我觉得有两方面原因，其它的我看过了，一方面离心时间和转速问题，另一方面是FICOLL，你可以换另一种进口的分离液试一下。我们之前出问题一般都是调这两方面，其它的我觉得没什么问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 19:55
7 P7 p- n+ {. H: {/ ?# t, Q回复 huajie881026 的帖子
+ }; i9 Y( e$ w6 A3 K  n2 k+ E2 ^1 G; R" j+ ]' r
我做的是骨髓的，和脐带血的可能还不一样。

9 x. x( k1 Q6 Q( k  T
嗯  好  我下次提高转速试试，谢谢指点！

huajie881026

神经干 发表于 2012-7-24 21:06 % r) l5 n9 v! A% [
我觉得有两方面原因，其它的我看过了，一方面离心时间和转速问题，另一方面是FICOLL，你可以换另一种进口的 ...

3 F- c7 A0 h6 v4 f& f
离心时间和转速我会再尝试，Ficoll我用的GE的，已经很好了吧，还有什么牌子的啊？比GE更好吗？可惜我已经订了GE的1.073的Ficoll。。。

wang66

我之前做脐血单个核分离也出新过这种情况，白膜非常不清楚，有个学长让我改用15ml的离心管后就好多了，你可以试试。
0 w& r3 T+ \; Q# {个人感觉50ml离心管的液面比较宽，细胞少的话白膜基本就薄得看不见了，用15ml的液面窄一些，相对白膜也就会厚一些，比较明显。