脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。
" @% \3 x& D- t* t4 R; f到底什么原因呢？？？ ( e" T( p$ O# ~9 b( X

9 k; d1 S  e8 ^$ R# V附上Ficoll说明书" `( E! C, X7 W) Y+ S' o. K

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11 7 s6 c/ s9 f0 K
这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

1 ~& z4 z) k2 I2 `) ^0 k- i哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56 5 `) U& U, e% s5 H4 K5 d: w0 |
1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧+ Z- [0 H6 n% s9 i) z! R& {3 V
2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序4 s  ^/ q9 ~% g0 I: O
3.细胞悬 ...

2 l8 t% C/ d) X# e7 G
1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
/ J* E$ m* j- b) F4 _; g1 H0 o. z2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度
5 I  U* S) I( H$ X& A, k. D  W3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了
8 P4 d0 i( Z) }& W  S4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？
; a7 |, T1 d8 z1 c9 S: n0 h5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC5 D7 k5 j1 Y8 C: |0 S- M! P: K
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请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？* D8 S) {3 Z* w( G# L6 o

( i4 s& k, i0 G; p/ z" C还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47 9 \0 }8 H9 D' ~6 I3 H' S* ?" s- v) v
你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

) x% E% ~+ T& l. g% H6 y' k& @是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。& @. R3 Y9 @! X- F' T8 H* I5 v
他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？
! C4 a5 w: \$ P3 {) A3 B+ t肿么办？白膜层不对劲啊！！！

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23 8 n, d# C* ]8 A" L- t  L
目测有两个个问题* X6 \; H( R8 t+ G" c) f( @
1.血液是否稀释，比例多少？* J. M1 }! d; A9 m3 _& f2 e& D
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

' o3 f2 A7 `5 M' i
1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的; R# l  o2 I9 ]8 j- ~  a9 F8 r
2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。

huajie881026

ly200101042 发表于 2012-7-24 15:37 3 a6 ?/ X! L" z7 h
我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min: U9 A2 F5 S) ^& G& n/ _3 {! n
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例， ...

/ S$ d' C" A* i" R+ N: H) N3 `关于离心时间我一开始是20分钟，可是出现这种情况后，我查了Ficoll的说明书说要30-40分钟，可是出来的结果还是一样，我就很困惑了。。。
) A3 @; _5 [5 E. ~血液是等比PBS稀释的，Ficoll与稀释后的血液体积比是1：2

huajie881026

crazytime 发表于 2012-7-24 16:24 0 q& D7 j; G. l% I# ^9 L+ A8 P
你试试将血液离心后，去除学清，用盐水稀释下，另外分离液离心时速度升降一定要调到最慢，基本上就是自然降 ...

6 M1 b% a8 e8 y+ H. A4 t$ `嗯  我下次尝试一下这个方法。
3 r+ k' N# U' \! V+ I4 A! Y% _* L离心时速度升降我都调到最慢了。。。

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 19:55
/ T0 C1 L6 \8 v! W* W: q2 E回复 huajie881026 的帖子
& e: B' ^4 W( [& E6 i1 ^/ o: s, m8 \1 s( z$ L% l
我做的是骨髓的，和脐带血的可能还不一样。

) k  a! k- e" P6 Z  c3 d$ L! R
嗯  好  我下次提高转速试试，谢谢指点！

huajie881026

神经干 发表于 2012-7-24 21:06
7 L* O7 [! H# h我觉得有两方面原因，其它的我看过了，一方面离心时间和转速问题，另一方面是FICOLL，你可以换另一种进口的 ...

1 s  j" m5 x# b
离心时间和转速我会再尝试，Ficoll我用的GE的，已经很好了吧，还有什么牌子的啊？比GE更好吗？可惜我已经订了GE的1.073的Ficoll。。。

huajie881026

wang66 发表于 2012-7-24 23:45 9 Z/ n+ Q* o; h$ [9 ^% X' E
我之前做脐血单个核分离也出新过这种情况，白膜非常不清楚，有个学长让我改用15ml的离心管后就好多了，你可 ...

/ H0 G# ]" T2 Q$ \我一开始也想过可能是这个原因，因为50ml直径粗，高速离心时它是倾斜的，所以可能导致白膜层不清晰。我想改成15ml离心管，可是这样的话就需要10个15ml离心管，离心耽误的时间很久唉。。。要1个多小时，而且取的话也要10管分别取白膜层。唉，我打算下次用15ml的试试，希望可以成功
7 h/ x) ?. Z4 U( m" E感谢指点！