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标题: CIK细胞培养一周死亡 [打印本页]

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-3 11:06 标题: CIK细胞培养一周死亡

CIK细胞培养细胞提取时数量还可以的，但是培养增殖不是太好，一周后细胞就开始死亡，请问高手们怎么没回事啊？请高手指教

作者: lyj-0017 时间: 2014-11-3 11:42

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简单说一下培养过程，添加的因子，培养方式（瓶子还是袋子？），你这样问怎么给你找原因？

作者: hefan1234 时间: 2014-11-3 12:45

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楼上说的对，需要具体培养过程和添加的因子，一般CIK的培养周期为2周左右。

作者: wilian2002 时间: 2014-11-3 16:55

啥流程

作者: lizzy_81 时间: 2014-11-3 18:04

细胞因子浓度，品牌，激活时间等都会产生影响

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-4 11:07

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接种浓度1.1x 106/ml，,第0天加1000单位伽马干扰素，第一天加100ng/mlCD3单抗、1000单位IL-2，以后每3天等量加液，这样培养一周细胞活力就开始下降，因子用的国产的，培养基用的Lonza的，是什么原因呢，是不是接种浓度低呢？请给分析下，谢谢

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-4 11:10

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用的是培养瓶

作者: lyj-0017 时间: 2014-11-4 11:31

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接种密度可以再提高一下，细胞因子用国产的没多大问题，CD3单抗最好换成进口的，培养基一般没多大问题。另外，D1天加因子时细胞有无聚团？

作者: 我是丁香 时间: 2014-11-5 09:58

有照片吗？重复试验了吗?

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-5 10:57

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D1天细胞有聚集，但没有明显的团块，有细胞团才能说明细胞增殖吗？另外我用的Lonza的培养基需要添加谷氨酰胺吗？您说的接种密度可以再提高一下，密度最好调到多少呢？非常感谢您的回复

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-5 10:59

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细胞没拍下来，新手刚做，一共做了3次，都是这样。能够分享您的经验？

作者: lyj-0017 时间: 2014-11-5 11:02

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密度的问题论坛里都有，大家都是建议密度高一点会更好，你可以调到2试试，但相应的D1天可能会出现聚集现象更明显。细胞后期扩增过程中出现细胞集落是良好的生长过程。培养基一般都是商品化的，里面应该都是添加谷氨酰胺的。

作者: hefan1234 时间: 2014-11-5 12:25

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接种浓度有点低，你采血量多少，得到单个核多少，培养基中是否加自体血清了?

作者: 我是丁香 时间: 2014-11-5 12:31

我们的经验，不管密度是多少，细胞都不至于会大量的死，最多是增殖差。“死”的含义是什么？溶解消失了？还是状态不好？

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-5 13:40

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我是用脐血培养的，50ml血，提取大约5x107个细胞，培养基加了50ml，没加自体血清，加上自体血清效果会好吗？血清怎么获取，里面含有抗凝剂呀？我们用的采血袋，里面抗凝剂是枸橼酸钠

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-5 13:42

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增殖差，台盼蓝染色有很多死细胞，显微镜下看细胞感觉细胞不完整

作者: hefan1234 时间: 2014-11-5 14:11

回复 sdzhxq 的帖子7 ?5 G* `" N# O) `4 ~
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脐血培养CIK也做过，但没有出现过一周就死亡的现象。血清获得方法是将脐血2800rpm，10min离心，获得的上清56度水浴灭活，1500rpm，10min离心后取上清。我们实验室用的抗凝剂是肝素钠。

作者: fenlichong 时间: 2014-11-6 00:29

本帖最后由 fenlichong 于 2014-11-6 00:31 编辑 ! |9 |: V* v5 ]0 t* x5 b
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最好附上照片，以确定形态是否正常，有无污染等。你收获的PBMC细胞纯度如何，是否高于90%？接种密度一般1-2×106个/ml就可以，扩瓶的话试试每两天扩一次。添加因子一般还有IFN-γ，培养原理及添加因子可参考此帖http://www.stemcell8.cn/thread-70676-1-1.html。不知按照你添加的因子及培养方式操作的话，你们实验室其他人员有没有出现类似问题？

作者: fenlichong 时间: 2014-11-6 00:32

最好附上照片，以确定形态是否正常，有无污染等。你收获的PBMC细胞纯度如何，是否高于90%？接种密度一般1-2×106个/ml就可以，扩瓶的话试试每两天扩一次。添加因子一般还有IFN-γ，培养原理及添加因子可参考此帖http://www.stemcell8.cn/thread-70676-1-1.html。不知按照你添加的因子及培养方式操作的话，你们实验室其他人员有没有出现类似问题？

作者: heirrii 时间: 2014-11-6 09:11

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我们也是用的枸橼酸抗凝。你分单个核用ficoll吗，有没有洗涤干净。得到的细胞加入50ml培养基有点稀。

作者: 沙漠狐o0 时间: 2014-11-6 09:39

培养基加多了。你试一下加10~20ml培养基...

作者: holy0606 时间: 2014-11-6 09:40

回复 sdzhxq 的帖子2 ]" s# E! l+ p: h5 M; e' `# \

CD3的濃度有點髙，50就可以，

作者: holy0606 时间: 2014-11-6 09:42

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1.5---2之間，試試看看

作者: 牵着蜗牛去散步 时间: 2014-11-6 10:12

一开始有聚团是正常现象，LONZA的培养基直接用就可以。有图片上张图片看看，关于接种浓度1.1x 106/ml 是可以的

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-6 10:44

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PBMC细胞纯度怎么确定是否高于90%？我们实验室培养方法基本都是一致的，有的培养出口细胞增殖倍数也不高，最高40多倍，不像文献上说的增殖几百倍的。

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-6 10:45

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谢谢，按照提供的方法试试

作者: sdzhxq 时间: 2014-11-6 10:47

回复 holy0606 的帖子# f8 \" \" D8 l' Y5 t: a
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我们用的CD3不是进口的，可以吗？下一步可以试试50浓度的

作者: fenlichong 时间: 2014-11-6 21:18

回复 sdzhxq 的帖子) u0 d! p% z2 V) z% ^7 ?* \9 ]8 J
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PBMC的细胞纯度我也不知如何确定，个人认为应该有如下几个指标：1.离心后获得的白雾状细胞层较纯，少红细胞参杂；2.多次洗涤离心，以去除混杂的血小板等；3.种瓶后镜检观察细胞形态是否均一。

作者: lyj-0017 时间: 2014-11-7 12:08

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文献上有些数据都是胡编乱造的，不能只看国内文献，多看看外文文献

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