CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2013-8-1 01:59 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】9 r# Q% r- R4 a- ?; U
      CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。# z/ u9 Y* ]) w0 n

【培养原理】
CIK培养用细胞因子和抗体：! S- Z0 K( f0 ?
9 ?( y+ w, v9 `8 {0 n
•CD3激发型单抗：. N! I/ A" N+ b; u3 a
      T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的
  抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与/ x5 u$ p* T7 l5 l8 F4 D
  CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4
  或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆的
  免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的. }6 w: [- B% G9 Y
  酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，
  最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的! h7 N0 {  ]2 `& l- Y
  表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。 3 w% Q& ~" \  u- Z2 C/ J
2 Q- P6 p% F) S; L/ j- }7 N
      由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特
异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，) M) c1 ]/ H' a/ @
从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引  D0 `5 B; R8 m5 b& N
起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。$ ]% u+ E& X. A$ K3 p9 m, K

      此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激
所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最3 c' `' Q. k, t  F5 `* G
好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
•IL-2 (白细胞介素-2)
      IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-27 i2 ~  e/ }2 ]6 V- F
既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活+ |% _. a+ ^9 {4 E
化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，1 E+ Q4 `5 z" N+ m# [- w5 K7 ]
以促进T细胞的增殖与活化。
•IFN-g(干扰素-g)
      IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在
  诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相
  关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
• IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
      IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提5 s, O& V4 L4 v
  高CIK 的细胞毒作用。+ }* r1 h; _: M* B! u6 h+ U
  ; G4 Q" }& T* D) n& d. f! e
【细胞制备】
1.  外周血单个核细胞的采集5 ]& T7 A1 f3 \
   1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
   1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；' w* B; @8 w) w
   1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
  2.  CIK细胞的培养及鉴定$ w7 k6 I) o. e: @6 h1 v8 A, Z7 ~' _
   2.1 将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培
            养箱中培养；
   2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖。4 q" E- g4 y) `7 t6 r9 V
            注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
   2.3    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；7 ~" K) J; x+ Q$ C  V
   2.4    在培养的第14d，收获CIK细胞。
   2.5    CIK细胞质控：
         2.5.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
         2.5.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
         2.5.3    细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效/ Q( L, w% v! {! m: B; G
                        应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200; ]; ~' F( h7 ^
                        ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀
                        伤率。
         2.5.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检, t0 h: s7 x8 t$ K3 h) j& }
                        测阴性，内毒素<5 Eu)。

【步骤简图】

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