关于转基因小鼠的鉴定问题，急！

hxf

我向别人要了杂合的ROSA lacZ/EGFP转基因小鼠，和野生小鼠杂交繁殖，有两对引物用来鉴定，一对是内参引物，另外一对是针对EGFP设计的引物，目的基因长173bp，每次pcr鉴定都只能扩增出内参引物，就是得不到目的基因，有哪位大侠给点建议，现在有5笼小鼠继续鉴定，着急中。

moluxingke

这种事情经常见，很令人头痛。有个问题是：你是两对引物一起P，还是每对引物单独P，如果一起P，两对引物的退火温度一样吗？
# [, }8 y, i0 d, x8 \+ k还有就是你单独P那个EGFP能P出来吗？P的时候一定要做好各种对照。就是说已经明确鉴定过的EGFP小鼠DNA，还有不带EGFP的小鼠的DNA。还有P不出来是因为这种小鼠就是没有EGFP。! _1 H2 V, |+ W& F# q; O+ f! C5 \8 p

% |9 @3 ?$ A. e最笨的解决方案：首先是确定PCR用的酶、buffer、dNTP都没有问题，然后就是确保引物序列没有合成错误。剩下的就是痛苦的PCR条件摸排了，比如退火温度，最好是梯度温度，还有PCR时间。
& w/ U" X- `+ m有的时候还要加DMSO等帮助PCR。

hxf

非常感谢moluxingke这位仁兄，我用的是2x的Mix，用了四种，退火温度也试过很多次，后来都只做阳性对照了，不管分开还是一起扩增，都是只有内参，目的基因的引物序列是没有问题的，我自己也设计了，得到相同的序列。实在没有办法了，现在换了一家公司，重新合成引物看看。不过我从来没用过DMSO，我也试试。继续奋斗！

细胞海洋

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你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样7 H$ Y4 @7 O- H% e

: m0 V' J. q, o# G( V- ?否则他会看不到

hxf

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# S2 r! Q* T# [* u非常感谢moluxingke，我用的是2x的Mix，用了四种，退火温度也试过很多次，后来都只做阳性对照了，不管分开还是一起扩增，都是只有内参，目的基因的引物序列是没有问题的，我自己也设计了，得到相同的序列。实在没有办法了，现在换了一家公司，重新合成引物看看。不过我从来没用过DMSO，我也试试。继续奋斗！

hxf

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谢谢，懂了