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Ben Emery and Ben A. Barres2 s1 Z0 q2 I @# P& s
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Cell 135, 596 – 598, November 14, 2008: T+ @: i2 Y( e* ]7 a
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研究中枢神经系统(CNS)中细胞如何协同工作的主要困难是大脑细胞组成的不均一性。Heiman和Doyle等在本期Cell介绍了一种新方法(TRAP)，不需要将细胞纯化到完全均一，便可在特定的CNS细胞群体中描述得到翻译的mRNA的表达谱。
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' I1 @ ?1 D; [# ? a 神经生物学目前面临的主要挑战是了解大脑中的大量不同类型的细胞如何相互作用，进而产生认知和意识。为了理解细胞如何相互交流，一个重要的方法是描述全基因组的基因表达谱。然而，由于哺乳动物中枢神经系统(CNS)细胞有高度不均一性，因此很难描述CNS的基因表达谱。CNS不但有许多不同的、决定疾病的区域，而且每一个区域都由多种细胞组成，其中许多是罕见细胞，这些细胞的mRNA只占总转录产物库的一小部分。尽管描绘大脑基因表达模式的宏大计划，诸如Allen和GENSAT，已为在CNS中许多基因表达的位点提供了重要信息，但表达这些基因的细胞的精确特性尚不是很清楚。另外，这些数据库不能综合性地把握在各种疾病状态或各种实验条件下发生在不同CNS细胞群体中的基因表达变化。一些有效的方法已被成功地用来描述从高度纯化的特定CNS细胞中分离的mRNA的基因表达。这些方法使用在特定CNS细胞中表达荧光蛋白的转基因小鼠，或使用可标记特定细胞的反向示踪物。尽管这些技术已产生了大量有用信息，但它们也有若干潜在缺点，如分离细胞的反应可能会改变转录谱。另外，由于研究的细胞类型不同，将特定的细胞分离到所需要的均一性非常复杂，因而要在不同的实验中得到重复结果或相同的细胞制备物以便评估转录变化几乎是不可能的。在本期Cell发表的两篇互为补充的研究论文提出了一项称为翻译中的核糖体亲和纯化(TRAP)的崭新技术，可用来测定大脑中特定细胞的翻译谱。, x9 r, }3 l- }% L, b
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GENSAT计划的数据库有一个基于细菌人工染色体(BAC)的小鼠中枢神经系统的基因表达图。BAC小鼠品系的制备使用了BAC转基因载体，在该载体中，目标基因内的蛋白质编码序列被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列置换，使EGFP处于目标基因的正常调节序列的控制之下。该EGFP报告基因整合进入小鼠中，EGFP蛋白的时空表达方式与内源目标蛋白相同。最近Heiman和Doyle等制备了新的bacTRAP小鼠，其BAC载体都为特定CNS细胞中的EGFP标记的L10a核糖体蛋白编码。用EGFP抗体对EGFP-L10a融合蛋白进行亲和纯化可得到核糖体及与之结合的mRNA，因而可以从表达EGFP-L10a的目标细胞中分离转录产物，这使先前在线虫中使用的技术得以提高。在线虫中，抗原表位标记的poly(A)结合蛋白的定向表达可从目标细胞中纯化该蛋白所结合的RNA，制作基因表达谱。# S0 d# I: g5 ^- O/ a# D7 r r
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为了证实这种新方法的用途，Heiman等分别在黑质纹状体和苍白纹状体中型多棘神经元(MSN)中，建立了通过D1或D2多巴胺受体启动子表达EGFP-L10a核糖体蛋白的BAC小鼠品系。通过免疫亲和方法从每种小鼠品系中纯化的mRNA不但富集了全部已报道过的在分化中表达的MSN标记，而且也揭示了大量在黑质纹状体和苍白纹状体中富集的转录产物。更重要的是，Heiman等还证实这项技术可在实验操作（可卡因处理）后，非常灵敏地探测细胞群体中的翻译变化。由于上述两类神经元对可卡因处理有不同的响应，因此可对可卡因的分子响应进行可被实验验证的推测。Doyle等进一步扩大了这项技术的应用，他们报道了在Heiman的研究中描述的4种EGFP-L10a bacTRAP小鼠的转基因表达模式。他们也描述了将EGFP-L10a核糖体转基因定位于各种不同的神经元和神经胶质细胞的另外12种bacTRAP小鼠品系。Doyle等使用这些bacTRAP转基因小鼠和通过对不同CNS区域的解析，报道了24种CNS细胞的翻译谱，包括星细胞、少突神经胶质细胞和各种类型的神经元。
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TRAP方法具有几项优点，使其与目前使用的方法有所不同。最明显的优点是TRAP方法在实验上相对简单，不需要进行繁杂的、技术上很困难的细胞分离步骤，因此即使相对稀有的细胞，如单极刷细胞，也可很容易进行研究。此外，这种方法极大地增加了得到可重复实验结果的可能性。Doyle等证实从有相同BAC转基因的不同小鼠品系中得到的结果高度一致。当然，选择能正确代表目标细胞的适当bacTRAP小鼠品系是极为必要的。最后，TRAP技术可以描述成年小鼠神经组织中特定细胞的基因表达模式，而目前用来纯化相同细胞的荧光活化细胞分类(FACS)方法，必须使用出生不久的小鼠。TRAP方法代表了一个重大进展，因为这意味着可以在有神经疾病的成年小鼠模型中描述特定神经细胞的基因表达。
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TRAP方法的重要一点是它以得到翻译的RNA为标靶，而不是作用于总mRNA，因此更好地反映了蛋白质表达。通过对TRAP表达谱和总mRNA表达谱的比较，可以鉴定处于强翻译控制的mRNA。有人说至少某些假定不被翻译的mRNA，如为神经蛋白Gap43和神经胶质细胞朊蛋白Prnp编码的mRNA也大量存在于TRAP数据中，这说明某些在翻译上受到抑制的mRNA仍可与核糖体结合。另一方面，不能被翻译的的非编码RNA（如Gt12）在与TRAP结合的样品中无法被检出，尽管这些RNA可在标准基因表达谱方法中被检出。TRAP技术需要加以注意的一点是，在制备组织溶胞物时，所有细胞类型的RNA都被混合在一起，这使来自非实验需要的细胞的mRNA也可能与EGFP-L10a标记的核糖体结合。但如果使用使mRNA与核糖体稳定结合的条件可减少这方面的问题。在大多数情况中，神经胶质细胞的TRAP基因表达谱确实非常类似早先得到的纯化的星细胞和少突神经胶质细胞基因表达谱。在这两种方法中有一个重要的不同之处，即细胞表达的mRNA的相对水平有所不同。尚不清楚这种不同是否反映了所使用的样品的生理学的不同（如CNS组织的年龄），或是否反映了实验条件的不同（如亲和纯化的效率）。无论如何，TRAP方法提供的可能性是无限的，因为理论上它可用于在任何条件下的任何组织中的任何细胞类型。在神经疾病的研究中使用TRAP是下一步研究中的一个重要领域。
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' X m: Z% y3 I5 C本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-22 22:55
发表于 2015-6-8 08:35
