《cell》文献翻译:基因表达的小RNA调节因子

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Joel R. Neilson and Philip A. Sharp
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3 H5 k  H) m& k% VCell 134, 899 – 902, September 19, 2008
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5 |) @3 [$ \6 L8 l    今年Lasker基金会承认了Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe在推断小RNA分子在真核基因表达的转录后调节中所进行的开创性工作。$ G  Y+ p' H4 k1 F

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, z# I6 @/ l" [6 `* I1 i    分子生物学是一门年轻的学科，如同充满了未开发土地的新大陆。有关小RNA在基因调节中的作用的重要发现是这门年轻学科中还有许多未开发的重要领域的一个例证。9月26日，几位先驱（麻州大学医学院的Victor Ambros、麻州总医院和哈佛大学医学院的Gary Ruvkun和剑桥大学的David Bulcombe有关小RNA的发现将被授予2008年Albert Lasker基础医学研究奖。% _/ M+ Y: k; D% ^9 A9 \

  E! Q, T5 V5 h. e: c; i    历史上先驱者以及他们的发现的意义通常被忽略，只是在很多年之后才被承认。Ambros和Ruvkun所发表的描述第一个微RNA及其标靶的优秀论文（发表在高深的Cell杂志上）被忽略了近10年。与此同时，Baulcombe在一个被遗忘（至少被美国联邦基金所遗忘）的植物分子生物学的一个领域工作。他发现小RNA分子与依赖于同源性的基因沉默（也称为共抑制或RNA干扰）有关，这意味着推测出了基因沉默的化学和生物化学。这些天才研究人员的工作从根本上改变了科学界对转录后基因调节的观念，证实了在小RNA分子起作用的动植物细胞中生物过程的复杂性。. N* Q; e/ T0 v5 N5 b- l2 Z7 v$ I# z

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" n2 z8 s2 [' V6 X1 Z! K    事情的开端与Chalfie、Horvitz和Suiston 1981年在Cell杂志中描述的两个线虫突变体有关。Unc-86和lin-4这两个突变体改变了通常不变的的线虫细胞发育。在这些突变体中，各种细胞系在某个发育点被“卡”住，然后反复重复细胞分裂模式。( o: i( w: ~: w- W5 O0 A

9 c* C0 K' m$ i, ~* \8 G    作为Hovitz实验室博士后的Victor Ambros被上述观察所吸引。他根据线虫lin-4突变体不能产卵的观察，假定其他不能产卵的突变也有类似的异常。对有产卵缺陷的突变体的检测揭示了lin-14、lin-28和lin-29突变体与细胞系发育异常有关。这些突变导致产生两类不规则的细胞系发育：（1）“早熟”，某些在野生型线虫中发生的发育过程提前进行；（2）“滞后”，某些在野生型线虫中发生的发育过程延后进行。基于上述观察，新突变体被统称为“非同步”突变体。" e/ @  G) f2 a. \; V3 y
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    在上述研究中揭示的最重要的基因是lin-14，该基因的各种等位基因有与早熟或滞后细胞发育相反的表型。有趣的是，lin-14的半显性滞后等位基因的表型与在lin-4突变中观察到的缺陷相同，而lin-14隐性早熟等位基因产生的发育缺陷与在lin-4突变体中观察到的缺陷相反。Ambros使用19个不同的突变体和lin-14温度敏感基因，很快确定了lin-14滞后突变基因是获得功能基因，lin-14早熟突变基因是丧失功能基因，并推断出这两类基因在发育过程的不同时间影响表型。这些数据表明lin-14的功能一般在发育晚期下降，由此产生了两个重要问题：（1）在发育过程中，lin-14的功能在时间顺序上是怎样调节的？（2）lin-14突变怎样影响其功能？/ x1 T5 Y  I( w/ u

+ `' N' ]& U* l4 g    回答这些问题的最直接的方式是在分子水平上确定lin-14基因的功能。为此目的，Horvitz实验室的另一个博士后Gary Ruvkun领导进行了包括Ambros在内的富有成果的合作。这些研究揭示了半显性的lin-14获得功能突变是lin-14基因3’区域的删除或重排。已知该断裂序列为一个对lin-14基因活性进行负调节的因子编码，但不清楚这种调节是发生在DNA、RNA或蛋白质水平。在此之前，Ruvkun和Ambros已分别在哈佛医学院/麻州总医院和哈佛大学建立了自己的研究小组。这两位研究者继续对非同步蠕虫基因进行研究，并于1989年各自独立发表了相关基因，特别是lin-14基因的深入研究结果。
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    Ruvkun制备了lin-14基因产物的抗体，证实该蛋白质位于所有受lin-14突变影响的细胞的细胞核中，但该蛋白质的表达有时间限制。在野生型线虫中，lin-14蛋白存在于幼虫发育初期(L1)阶段细胞的细胞核中，而在发育的下一个阶段(L2)不复存在。相反，在lin-14获得功能突变体中，Lin-14蛋白质的表达在幼虫发育的所有阶段都持续进行，甚至在成虫中也可观察到lin-14的表达。这些结果是对Ambros的遗传学研究的补充，提供了在L1/L2转换阶段，Lin-14蛋白质表达的下降对正常发育至关重要的补充证据。( Y, [6 C8 k7 T% F

2 T' X, R! S3 s) ?3 K    在Ruvkun的研究发表了2个星期之后，以Ambros为作者的研究得以发表，描述了lin-4、lin-14、lin-28和lin-29突变体的异位显性分析。Ambros通过分析携带这些突变的各种组合的线虫，使这些基因进入一条令lin-4对lin-14和lin-28进行负调节的途径，然后lin-14和lin-28对lin-29进行负调节。Lin-29在同时缺少lin-4、lin-14和lin-28的情况中，可使线虫幼虫完全转换成为成虫。
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    尽管已很清楚lin-4基因可使lin-14和lin-28基因“关闭”，但异位显性分析无法确切地解析lin-4是分别调节lin-14和lin-28，还是通过其中一个基因调节另一个基因。尽管如此，由于lin-14获得功能和lin-4丧失功能突变体有类似的表型，Ruvkun和Ambros都推测lin-4可能是通过在lin-14获得功能突变体中丢失的因子对lin-14进行负调节（可能是直接调节）。+ B+ m7 A, v( l5 T8 q4 M
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    Ruvkun在约2年后发表了背靠背的研究，对lin-14调节的性质有了新的了解。对为lin-14编码的遗传基因的深入分子鉴定揭示了lin-14获得功能突变位于lin-14基因编码的转录产物的3’非翻译区(UTR)，表明这类突变不影响蛋白质编码序列。由于在这些突变体中lin-14 mRNA表达水平正常，所以突变很可能破坏了一个作用于RNA的负调节因子。
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) ^; Y1 O& c! Y; t0 J9 d4 D    Ruvkun小组通过分析lin-14蛋白在非同步突变背景下的表达，证实了lin-14受lin-28和lin-4的拮抗调节。尽管在lin-4丧失功能突变体中，lin-14蛋白的表达在其后的L1阶段并未减少，但在lin-28突变体中，lin-14蛋白的表达在L1阶段提前消失。这些结果理清了Ambros提出的途径的顺序，表明lin-4基因产物（或某种由该产物调节的因子）可直接与在lin-14获得功能基因中缺失的lin-14 3’-UTR区域直接结合。剩下的问题十分清楚：lin-4的分子特性是什么？lin-4是直接还是间接调节lin-14？两年后Ambros和Ruvkun进行的背靠背研究回答了这些问题。
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    Ambros的研究描述了lin-4基因的分子克隆。令人惊讶的是，产生lin-4表型的几千碱基的基因组区域只需693个基因组碱基对便能得到互补。从几种不同线虫中得到的相应区域也能援救lin-4表型。尽管Ambros及其团队的深入分析揭示了在四种线虫中有两个保守的DNA序列区域，但他们无法鉴定任何可能的蛋白质编码序列，无法在这些区域鉴定出规范的起始或终止密码。破坏潜在编码序列的突变对lin-4的援救没有影响。7 l) K$ A% ?6 J  A$ [
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    Ambros等迅速向前推进。Northern分析揭示了lin-4基因区产生两个可测定的RNA：一个微量的61核苷酸产物和一个主要的~21核苷酸产物。这两个RNA产物相互关联，小产物相当于大产物最靠近5’端的21个核苷酸。为了证实这两个RNA确实影响lin-4基因功能，Ambros实验室筛选了20000多个染色体，鉴定了第二个lin-4突变，称为lin-4(ma161)。这个突变体基因在两个lin-4基因产物的5位有所改变，从胞嘧啶转换成胸腺嘧啶。因此这两个基因产物中的一个或二者肯定可影响lin-4基因功能。
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    与此同时，Ruvkun及其同事继续对他们早先观察到的lin-14获得功能突变所处的lin-14 3’-UTR区域进行研究。用处于不同发育阶段的线虫进行的免疫印迹和核糖核酸酶保护实验清楚地证实，lin-14基因是在特定发育阶段受转录后调节。在野生型线虫中，尽管在幼虫发育的第一阶段后lin-14蛋白不复存在，但lin-14 mRNA在所有幼虫阶段，甚至在成虫阶段都稳定表达。Ruvkun的团队在线虫C. elegans和C. briggsae中使用报告基因证实了lin-14的3’-UTR对所观察到的转录后调节是足够的，这种调节在两个lin-4突变体[包括经典的lin-4(e912)和新分离到的lin-4(ma161)基因突变]中受到破坏。Ruvkun和Ambros的研究小组都注意到从lin-4基因产生的小RNA与lin-14 3’-UTR中的7个部分重复序列互补(lin-14 3’-UTR在lin-14获得功能突变基因中或全部或部分缺失)。Ambros和Ruvkun的结论是lin-4基因产生的短RNA通过与lin-14 mRNA 3’-UTR的重复序列的碱基配对，对lin-14基因产物进行直接调节。5 V4 f/ x& R" `
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    Ruvkun研究小组在一项后续研究中基本证实了lin-4和lin-14之间进行直接相互作用的模型。他们证实在推测的lin-14 3’-UTR的lin-4结合位点的点突变可在体内破坏报告基因的发育阶段专一性调节，在杂合UTR上进行有凸出结构的潜在lin-4位点的引入可产生发育阶段专一性调节。此后不久，Ambros的研究小组确定了lin-28是lin-4的第二个靶点，获得并鉴定了一个lin-4获得功能突变基因。另一项研究证实，lin-4通过在lin-14 mRNA翻译起始后阻断lin-14蛋白质合成而发挥作用。但这些观察对已有的基因调节的规则的重要性尚不清楚。除了线虫，没有其他有关lin-4基因产物保守性的证据。即使在线虫中，lin-4也是以这种方式起作用的小RNA的唯一例子。
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% h8 f- C8 C3 X* b8 m4 c) I7 L    当Ruvkun的研究小组与Horvitz和Ann Rougvie的实验室合作，描述了let-7基因的分离和鉴定时，事情有了根本的改变。let-7与lin-4类似，为一个小RNA编码，这个小RNA通过在该基因3’-UTR的保守序列对另一个基因(lin-41)进行负调节。与lin-4不同的是，let-7在各种动物中广泛存在。在描述了let-7后的短短二十个月后，Ambros、David Bartel和Tomas Thschi的研究小组同时发表了证明有几百个类似于lin-4和let-7的基因存在的研究数据，这类基因存在于从蠕虫到人类等各种生物中。微RNA被再次引入科学界，这一次引起了科学界的注意。5 `4 Q; r+ ~3 C0 b; W' Q
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植物中的短RNA和基因沉默
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( n. e: X5 V; k  f: ]& E    在动物中存在着几百个为起调节作用的短RNA编码的基因，这项发现令人震惊，但在植物中的研究显示了调节基因表达的RNA的重要性。2 i: J+ t% V1 q$ q/ Z
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    David Baulcombe在90年代初期研究经基因工程改造后的植物的病毒抗性。那时的主要方法是通过病毒蛋白或有高级结构的核酸基序的转基因超量表达，竞争性地抑制重要的病毒因子或寄主因子，主动干扰病毒复制。但是很快就认识到即使转基因不为蛋白质序列编码，也能通过该转基因使植物产生病毒抗性。用带有序列同源性的病毒感染转基因植物导致病毒RNA和转基因RNA稳态水平下降，尽管来自转基因的转录保持不变。这些观察产生了这样一个模型，即病毒抗性是通过可降解病毒RNA的转录后机制介导的。在转基因植物中，病毒抗性和依赖于同源性的基因沉默之间的相似性说明这两个过程有相关性。
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: b. w" U6 O( S8 V+ l    Baulcombe研究小组在90年代中期发表的一系列植物研究中，强化了依赖于同源性的基因表达和病毒抗性之间的关系。他们的第一项研究比较了几种转基因植物的病毒抗性，注意到产生病毒抗性的转基因可产生较低水平的稳态转基因RNA，可反式抑制来自其他转基因的同源RNA的累积。这些转基因产生的病毒抗性有高专一性的特点：对某些马铃薯病毒X品系有抗性的转基因植物株对与该病毒高度相关的品系没有抗性。7 T) ]) w9 n4 `6 X) Y

$ G7 L% {$ x8 o+ h7 U% U    Baulcombe的第二项研究证实，非病毒转基因的沉默可阻止经基因工程改造过的含该转基因同源序列的病毒的累积。这项研究揭示了是序列特性，而不是序列来源，造成了沉默的转基因与植物RNA病毒之间的相互作用。另外一些研究使用了从番茄黑环病毒感染后“恢复”的植物，揭示了这些植物对第二次病毒接种的感染有抗性。尽管恢复后的植物对其他病毒敏感，但如果在用于第二次接种的杂合病毒中含有在第一次接种的病毒的RNA非编码区，这些植物对对第二种病毒有抗性。在病毒诱导的保护与转基因诱导的沉默之间的相似性使Baulcombe得出这两种现象都有基于RNA的机制起作用的结论。8 ], `, @, r7 P. L5 Y% W
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    之后不久，Baulcombe研究小组使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因烟草的土壤杆菌入渗，证实存在着一种可介导植物转基因的序列专一性沉默的系统信号。GFP的系统沉默也可用包金颗粒DNA进行诱导，在与沉默最早开始的根部结合后，可扩散到非转基因组织。沉默信号扩散的方式和动力学表明它可通过细胞间的胞间连丝以及通过韧皮系统进行扩散。沉默信号可能是一种核酸。* T( M( k. A1 l8 ~
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    尽管大多数证据认为各种形式的转录后基因沉默（包括共抑制和抗病毒活性）的中介物是反义RNA，但没有人鉴定出对靶序列而言是反义的RNA。Baulcombe推测用来寻找与转录后基因沉默有关的反义RNA的方法可能漏悼了“很小的、非均一扩散的”RNA，它们很可能是植物编码的依赖于RNA的RNA聚合酶的产物。Baulcombe在1999年与Andrew Hamilton一起完成的工作证实确实如此。
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    对三个显示了内源基因的转基因诱导转录后沉默（共抑制）的转基因番茄的研究揭示了与转基因相对应的正义和反义~25核苷酸RNA。有趣的是，在其他有相同转基因但不显示共抑制的番茄中没有这类短RNA。他们进一步证实，在有转录后基因沉默的转基因烟草中存在反义RNA，尽管这种烟草的转基因与内源序列没有任何同源性。在转基因不沉默的烟草中没有这类反义RNA。短反义RNA与沉默的基因有关的现象在另外两个基因沉默模型中也能观察到：（1）在土壤杆菌渗入后的系统性转录后沉默的过程中；（2）在用马铃薯X病毒感染的植物中。很清楚，一再被观察到的不同类型的转录后基因沉默的相似性有一个共同点：短RNA与被沉默的基因有互补性。
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前瞻
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: e, c7 X- ^# O! M+ d7 [    Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe的开创性研究揭示了小RNA在调节各种生物基因中的重要性。RNA干扰的生化分析导致了小干扰RNA(siRNA)的发现，siRNA已成为使哺乳动物基因沉默的普遍工具，并有可能成为治疗疾病的药物。微RNA可调节一半以上的哺乳动物基因，各种不同微RNA的活性与癌症、炎症、神经发育和慢性心脏病有关。在植物中，这些RNA通过启动另一些反式作用小RNA的产生，调节各种发育过程。不了解小RNA所起的作用便无法理解多细胞生物的生物学。' Z# z% c) v, d' y  W% ?
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    可能还有许多由不同过程产生的其他类型小RNA，它们有不同的功能。例如，piRNA是一类新的小RNA，它们主要存在于生殖细胞中。这些RNA至少是部分通过表观遗传学机制控制生殖细胞中重复序列的表达。尽管存在许多较长的的非编码RNA，但它们的特定功能还有待确定。这方面的例子包括Xist RNA与X染色体失活的关系以及U19RNA与lgf基因的印痕关系。在脊椎动物中有几千种这类RNA。Ambros、Ruvkun和Baulcombe的突破性研究凸显了我们对非编码RNA生物学的理解才刚刚开始。
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本文转自建人先生原创，感谢