冻存的MSCs复苏时几乎都死了，怎么办啊？

lijie_suc

前段时间培养了一批MSCs，长的挺好的，后来就冻存了一部分，过了半月再拿出来复苏的时候都死了，实验都进行不下去了，怎么办啊~+ T1 e' j# X9 G* K0 X
冻存步骤：1.冻存前一天全量换液
2 y; y2 K7 a' s: @7 E7 w               2.吸弃培养液，PBS冲洗一次。0.05%胰酶37℃消化1.5~2min。
5 _8 U- N/ L, F/ ^               3.加含10%NBS的DMEM终止消化，继续吹打，使细胞悬浮。$ X" g6 g/ C* }# D. B3 \
               4.1000r/min离心5min，弃上清。
  |* o, d9 e, H4 c) B               5.加冻存液1~2ml，细胞计数。约1*105个/ML。5 U+ k! q# ~' w0 ?1 |5 U9 V
               6.程序降温：4℃30min--------零下20℃ 60min——零下70℃) s+ w( x4 O; n* s9 Y* S6 E# T
复苏：7 K" ]0 L: G. K3 J4 u% i
零下70℃取出——37℃水浴加热至融化，中间不断摇晃加速融化5 D& W2 V- B% p, q5 `' m# j
冻存液:基础培养液=1:9混匀，1000r/min离心5min，弃上清，加3ml基础培养液混匀，接种。37℃ 5%CO2 培养箱中培养。
$ y% x& O, K5 |. c次日观察细胞生长状态，发现细胞悬浮较多，只有几个贴壁细胞。全量换液后，隔天观察，细胞生长及其缓慢。

小猫狸狸

冻存液不需要加血清吗？加20~30%血清试试

lijie_suc

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/ S! q7 e% r) ^
; H3 ^+ j; u* b  w冻存液：
' M* a0 w% |3 P2 V7 v% ODMSO：血清：DMEM=1:2:7

干细胞观察

回复 lijie_suc 的帖子" I2 y: G# H' W& v
+ i. ]( |% b8 x1 ?9 q$ D* E

4 B; t6 W- h2 J2 i$ m5 I( r5 P2 U, F: `
基础培养液？没加血清嘛？不加血清不贴壁的吧。

lgfffancy

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( N" o4 a: u  R. i! e
* A2 |( v) z' L1 k7 b) ]9 v5 _你这个太简单了，你复苏的时候当然是用全培养基，你还用basic medium，请问营养物质从哪里来，不死才怪。

lijie_suc

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; z" e7 T/ }  }6 ]- x! U: w5 ?; r" F6 i2 ?9 x
10%FBS+90%DMEM

小猫狸狸

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* s3 z0 b; T0 s/ b0 n0 G$ P& V0 _# K$ C8 c# f7 ~: Q6 b
看后面评论复苏用的完全培养基对吧。如果是这样的话，检查有没有水浴时间过长。排除以上两个因素的话，主要原因就出在冻存上了，看看是不是冻存前细胞较密（或者胰酶浓度较低），消化时间较长，造成部分细胞消化过度，同时注意去除胰酶残留。

lijie_suc

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# P6 p0 `' X! G4 v) M
+ B$ X1 r7 ~' r: v+ T) s( q用的是含有10%FBS的培养液。。这样不行吗？

genhaoxin

可能冻存液有问题，我们用5-8%DMSO+FBS冻存，复苏活率几乎100%；复苏时，融化的细胞悬液直接加入到完全培养液中，第二天贴壁后换液。

lgfffancy

冻存液要避光保存