冻存的MSCs复苏时几乎都死了，怎么办啊？

lijie_suc

前段时间培养了一批MSCs，长的挺好的，后来就冻存了一部分，过了半月再拿出来复苏的时候都死了，实验都进行不下去了，怎么办啊~
* m4 h  M8 T) Z冻存步骤：1.冻存前一天全量换液
8 l4 d# ?3 Q: ]- z; A) C; H               2.吸弃培养液，PBS冲洗一次。0.05%胰酶37℃消化1.5~2min。6 {  w2 R# L6 l# s2 h! p) F0 V7 v
               3.加含10%NBS的DMEM终止消化，继续吹打，使细胞悬浮。& N& O3 N0 Y2 Q7 k  {& O
               4.1000r/min离心5min，弃上清。
" m, N" j! n9 _; B; P6 I               5.加冻存液1~2ml，细胞计数。约1*105个/ML。
9 T( i& I1 y- d1 _6 ]5 l+ d               6.程序降温：4℃30min--------零下20℃ 60min——零下70℃
+ z" A. i; E) K( q) T# b) s复苏：
' ^6 D. |- D. J# @8 v9 l' \0 H零下70℃取出——37℃水浴加热至融化，中间不断摇晃加速融化
( ?: ^+ o' p# o% A! T+ t冻存液:基础培养液=1:9混匀，1000r/min离心5min，弃上清，加3ml基础培养液混匀，接种。37℃ 5%CO2 培养箱中培养。
; t) s7 f3 D3 k/ O1 A次日观察细胞生长状态，发现细胞悬浮较多，只有几个贴壁细胞。全量换液后，隔天观察，细胞生长及其缓慢。

小猫狸狸

冻存液不需要加血清吗？加20~30%血清试试

lijie_suc

回复 小猫狸狸 的帖子. ~/ Q' Q) r6 l6 L0 i, [! O

( S+ u% a6 ]- S& e2 g冻存液：
; O+ b+ d1 C) |" IDMSO：血清：DMEM=1:2:7

干细胞观察

回复 lijie_suc 的帖子2 T. d7 D- Y9 F

, J( w  |. u4 e' z& P- E
8 \$ F1 m2 C1 D* U) D' v- v  v- C5 N# ~: w- w( Z
基础培养液？没加血清嘛？不加血清不贴壁的吧。

lgfffancy

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, k% S) T+ B1 p: T* B0 W) N
' I9 W+ b  K. ~" m  @. B你这个太简单了，你复苏的时候当然是用全培养基，你还用basic medium，请问营养物质从哪里来，不死才怪。

lijie_suc

回复 干细胞观察 的帖子
- }& s5 U$ f. N$ H" [! p( [4 X, T6 I$ u8 ^, R* w6 x
10%FBS+90%DMEM

小猫狸狸

回复 lijie_suc 的帖子5 n4 x6 l9 ?" ^7 \2 y

, r9 {) j6 A& |6 @  _3 C看后面评论复苏用的完全培养基对吧。如果是这样的话，检查有没有水浴时间过长。排除以上两个因素的话，主要原因就出在冻存上了，看看是不是冻存前细胞较密（或者胰酶浓度较低），消化时间较长，造成部分细胞消化过度，同时注意去除胰酶残留。

lijie_suc

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# ]. Z# p& m- H9 S4 r! k- b; D, x% t0 u; U" a5 i- I- P* q, D
用的是含有10%FBS的培养液。。这样不行吗？

genhaoxin

可能冻存液有问题，我们用5-8%DMSO+FBS冻存，复苏活率几乎100%；复苏时，融化的细胞悬液直接加入到完全培养液中，第二天贴壁后换液。

lgfffancy

冻存液要避光保存