胚胎干细胞培养标准化操作规程

风云动

   一般培养--维持ES细胞处于未分化状态$ Q! W/ @, R! u/ K5 M* N/ l; f
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
- ]- H1 Y7 W+ [# n# w8 ~/ U; @9 `" y! ^% u& E: K' s
' w6 V3 S9 o" q- o7 `! x
培养基) {0 T2 l" y# \- Y) a
ES:
3 T( P& L* k) g/ ?3 s0 _" G配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。$ y) k9 ?5 Q, u9 T

; A! C0 i2 E* n  {8 ~1 v贮存液
* h. d3 j1 E7 B) _0 MDMEM（高糖）   `+ v2 V7 F, ^5 N' H
马血清（HS） + x. ^6 x( k8 |: @) b4 q) ~
L-谷氨酰胺（200mM） " H/ ~( ]1 `3 m! K$ Q6 P1 X
MEM NEAA（10mM）
" b' b& E, ?( m3 ~4 ^/ VHEPES（1M）
' p/ u- W! f: n* @/ |# s9 L: Pβ-巯基乙醇（55Mm）
) c1 T$ I& c9 _+ w1 b8 I5 @PEST 5 R6 B* _; i; v  p$ q. x+ b* v# A7 X
ESGRO
4 F& W0 B6 K' m4 F. O% C% i! ?  l: _( M' ?! H( N
复苏细胞
' c1 K& C1 W; F# t; F8 g细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。! n, U, K  v. Q( g3 a

, v- L0 r0 C. X5 h* g步骤：( F9 x/ G' k7 B% e' L
1．从液氮中取出一管细胞；
, j" L' v( ]( [& u) b' \, d2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
# r1 `1 Z. x# F% I$ j8 K3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4 a) u' @  n- n6 f  `
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；* c8 v  `) Z1 l
5．离心3分钟；
0 A# N/ ^: m  Y% f: Y6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
( a* X! ]. q+ j8 A8 g  ~# U7 @7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；( N, S. f9 M; d" V; d$ }
8．孵育。
9 R5 H4 M8 P% Z; C5 a0 v! c( {% q1 ?
冻存细胞
, a7 J! s8 u5 t6 Y: H, S; J冻存液
9 t5 Y) y, X$ K90％HS和10％二甲基亚砜
0 a+ o" d  r$ [
2 q$ f/ k% ]( o! j$ l: q步骤：* U) B# ~; G5 ~8 g4 X
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
4 Z* ^1 h8 S& e" F( T! g. J! w2．用细胞刮刀收集细胞；
: w5 q0 Z- p5 L% Y( O3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；+ d# i8 _# ]4 w" W* y
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）! h7 I7 Y' Z% }
5．分装于冻存管内，每管1ml；
' ~2 m# P1 T0 n: s6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。0 P  O3 _, a/ F5 C/ i* ]

- J5 K9 z# a, u& ~/ N' s1 d明胶包被
& ^( R1 z% _' B" {& f5 Y准备500ml 0.1％明胶溶液6 H! v% A% ]0 a  e/ q3 g6 T1 r% a
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
9 l" K7 e' Y( F( R& G% V0 t2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。: H4 B$ w" m0 R* }
包被培养板或培养皿
: ?4 l7 m8 ?8 J0 A9 K1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；, V% c! m) z. e- D( R. Q
2．置室温30分钟；& z4 X& d0 }! P
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。