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- 积分
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- 威望
- 72
- 包包
- 1670
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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
6 e& Z9 j/ Y( A% DES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
- b6 e0 {$ s l
) W$ K. P# R# D
$ r& N' J. J" U3 P培养基3 R7 m: T# Q! z) M* @, N
ES:
# R) e$ i5 a4 Z% Y配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。3 s* H% L! z$ U/ ]% r9 y
. q1 E& o: ?) l" A" Z: Z
贮存液 6 j3 r$ A2 M% N+ R+ G! c* v
DMEM（高糖） 1 q" T; W7 N- h4 Z, R k
马血清（HS） # q1 s/ b6 Z8 J4 v# ^
L-谷氨酰胺（200mM）
# o. O4 V# s/ x& s% s9 A6 l5 {0 gMEM NEAA（10mM）
4 b( v0 L, Q& s `HEPES（1M）
. T7 o, t% D) h( e) \( _β-巯基乙醇（55Mm）
- V. l* W) I2 h. p" JPEST 8 d' \* H3 ]5 i1 M/ P# s; w4 q: Y
ESGRO
2 K' q1 m" z' z; d5 n3 v2 A* J
9 g6 B! P7 H/ U9 B复苏细胞9 r9 @/ E* d) I+ Z0 [
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
5 p* @/ Y; X; x& P7 E* }5 r" j7 w* t7 f& j9 ~$ \' t$ ?
步骤：1 N Z' e$ _* K/ {
1．从液氮中取出一管细胞；9 k% t' ?2 R" [
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；0 C& X, J- G. k5 ?
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
$ S, p0 l$ a& U7 J4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；6 w: N! f7 {( `9 _1 o. b/ ]
5．离心3分钟；
( d: b& D- f, o% B5 s6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；6 t( S3 |- \3 H
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
' j3 ~4 n/ n+ `8．孵育。. S# Y/ [4 t& l* G
* k% m$ t: q) w) ?5 c9 r+ e: ^
冻存细胞& H9 c5 U% H( C, R; B6 E
冻存液
4 r4 y8 _; [' R. j90％HS和10％二甲基亚砜) j9 ~; X- N/ ^; r$ Z' h& A. B
, k! T+ y2 `0 J% g# Q
步骤：% P5 p/ X: a" h. a* k* |
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
- H3 { t7 _/ K* U$ V# V4 r4 u" Y; ^7 Y2．用细胞刮刀收集细胞；
! i$ E$ X6 z# Y+ Z1 [+ }1 J3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
/ ?7 R% A1 x, `' `; j4 ~9 e4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
/ m* ^& }6 X8 j5．分装于冻存管内，每管1ml；* u$ n0 {9 u. t0 [2 I; g( b
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
' L3 `. Q) q& L) z& ]* {- I0 c. [& O% s9 y0 T3 q0 m) U( b2 R% H
明胶包被" X% T2 Z2 R) K" s: \
准备500ml 0.1％明胶溶液8 K. }# H( J$ l, D
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。0 K- f) c. A# F8 g5 M" @' x
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。9 h c, c- @8 q# A5 Z
包被培养板或培养皿+ S( c" q8 f" C$ ?( C: I% b7 v+ Z2 I7 X
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
+ W: U3 }# W# m- C2．置室温30分钟；# k- X% j/ Z8 b0 |
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
