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- 积分
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- 威望
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- 包包
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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态5 S9 J$ Q6 O3 q, k: `
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
* c( K. }) H% n1 X! K+ N
: D( O6 `4 v9 l
! Z: X" C6 t! ?6 l, t, Y$ [3 R# n培养基' H9 }+ A* T8 J- \* w( ]9 o1 P
ES:- z8 p$ m. t2 i5 U" ]) E( Z2 D8 z
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
. S9 O* E' b0 n; L$ b1 p$ t! Y5 K0 Z6 _
; O# V4 i& @: ^7 L6 n+ w$ u8 _贮存液 1 P; r0 P& Y; {7 F
DMEM（高糖） + G L1 d: e! j" V# A* B x
马血清（HS）
0 o! [; o# O! \& i0 BL-谷氨酰胺（200mM）
6 ]1 u' [- d9 E/ k0 A3 [7 `3 \MEM NEAA（10mM）
; O& z6 ~& U+ Y* G& DHEPES（1M） * ^5 q; w& N Z
β-巯基乙醇（55Mm）
2 K3 m4 U3 f. _* X0 OPEST - K6 v& o5 z5 O ?( O- L4 n4 Q! Y- c
ESGRO
* G' v) ?* U* y( c" \" k; k3 ]! r; J' i& S9 M5 C) U- R/ P
复苏细胞
2 H6 l# x- Z" |2 W细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。5 i+ a: ^' _: S" j
3 n2 b1 c3 x @2 A+ B( f% s
步骤：# l! p& T* v- L4 h
1．从液氮中取出一管细胞；
2 h8 E+ `' k& ~; f! B( B3 a7 Y1 Y2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
8 Z% X* v6 x5 ~1 `3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
6 c/ h4 R1 |8 X6 B4 A& _, U4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；/ f4 ~1 u" g* _& s( g% _
5．离心3分钟；
7 X$ C. ]) o) t. W- Y9 ^: h6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
0 }* J2 D6 t" _- D- i4 g% |7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
, Q/ ~8 ]9 b6 t$ p$ j& s8．孵育。# G' G* x, X3 q. L5 a% x1 R5 J+ e
. t; K4 i4 A4 H2 b冻存细胞 l; i3 P9 w7 o7 |
冻存液
, W2 [, T1 S! o' [' l90％HS和10％二甲基亚砜: K# r+ ^! p$ w5 M/ O
7 \! X" X) K" P' `
步骤：; s4 D0 d9 ]2 C* ]3 y9 I
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；$ U4 l5 o2 _, o5 I' I. \
2．用细胞刮刀收集细胞；! b+ b9 I5 A' e4 Q# f1 `4 m+ N
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；5 a# X1 p( W& j" r% J4 J+ _
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）' L8 r; H+ n$ M9 f
5．分装于冻存管内，每管1ml；/ G( s" P2 M, v) ~8 l9 ?
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
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9 p9 [& ^& p$ U明胶包被8 M2 i4 ]" M) r6 C
准备500ml 0.1％明胶溶液. w# V$ D! a* `8 L
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
! D' }* G4 g% p9 u2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
( _9 X) |" m! D$ P) d$ \7 Q2 n8 e包被培养板或培养皿
! ]* G/ _" P0 v: h, ]) B# w1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；+ |& Q" K; C% H ?0 g2 A9 s9 v
2．置室温30分钟；
9 v/ I" T) Z* \; I, U$ a: \3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
