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- 积分
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- 威望
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- 包包
- 1670
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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
/ c3 [, [* ?2 c5 ?( K( SES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
5 @' g) a! A' e$ B" P. D( \
4 @3 K% J$ e& s( m, \0 f8 @3 n, r* t5 U/ E3 k) m# w5 K0 \
培养基: E& [2 l# a! j6 S' X/ z2 N6 x
ES:
& s2 h- W# ~$ u配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。2 E9 h& B0 c* V* L
1 T- c0 c# f. |) s2 l/ n7 p
贮存液 5 }5 N, L. i9 u% c) `7 @
DMEM（高糖） 3 X3 _6 H, _! }. y. I
马血清（HS）
/ ^& H% J/ e8 k6 @+ ], j( ?L-谷氨酰胺（200mM）
" u! B9 C, i8 K/ U0 \1 KMEM NEAA（10mM）
/ l/ X# x% `! v3 Y9 DHEPES（1M） 0 ]3 p: \1 r& m6 ^% |
β-巯基乙醇（55Mm） $ c0 \8 U+ J3 w
PEST
. e1 @0 W4 w. LESGRO
- S3 m3 ?" V/ [
- b j0 F7 t+ Q& ?. v复苏细胞
$ ~& @- d; ]6 L) n$ \细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。6 z4 v" v" B; V. @
. O2 `+ u4 i0 S0 t( k
步骤：: g# n) k2 I# n% F. X& ]
1．从液氮中取出一管细胞；
: J( ^8 P; i4 I9 s2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
. a6 Z4 M. L4 F) h: D/ F3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；% J9 R; L+ H% ]; |$ p3 X
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
& l" I' r& ^# W p5．离心3分钟； ]+ ]. k4 k8 N/ ~+ B8 t
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；9 C, ^2 P8 x9 H
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
1 |7 m* l+ B! ~8．孵育。
' K; [. j5 d6 C5 A5 X- F% F+ F
# E& U* x1 U) D, m. |( [; p冻存细胞6 i+ r2 j2 F. x. }: S4 ]
冻存液" w& d' g9 |; o) m; B4 h
90％HS和10％二甲基亚砜' }- w$ S: q7 }& p
N/ j8 x" ]$ A7 q步骤：
1 I. O% Q& R) e: W- }& }1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
3 I$ j0 r4 G# _, L8 `3 R8 u" d2．用细胞刮刀收集细胞；# q6 E O8 T L% k- H ?' K5 s/ I! D
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
" U! d. P! ^# Q& w! Y4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）! L* O) X" [/ Y4 d& E7 N2 ^
5．分装于冻存管内，每管1ml；
! P! q- l3 j* K0 N% a9 x/ v, _* F" X6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。) U- q- y* X2 `) o5 J
6 ]" y' W' B+ S8 H& g6 d7 |9 a* D
明胶包被
7 P" |/ y# G: M; F' W2 V准备500ml 0.1％明胶溶液
6 a; _. P N( j$ ~5 r8 y5 Y1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。. X8 p( N) g- q/ b1 v$ P. X
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
! |% n, R8 N6 U9 g, N& G( i包被培养板或培养皿
/ R) f+ _8 P3 `, U: V( u1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
. V R! z. y( k' K2．置室温30分钟；
7 t, Q& K$ d$ l6 u' T! L# _" @3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
