脐带间充质干细胞的分离

Diane0321

实验要用到脐带间充质干细胞，但是我刚进实验室，也没有分离过，求助有经验的大神们，有没有比较完整的分离和培养步骤以及注意事项什么的，谢谢~~

smile微微笑笑

1、无菌收集脐带：在超净台内将脐带浸泡于含有1%（v/v）庆大霉素的生理盐水中，除去脐带外表及内部残留的血液，洗净后将其剪成约2cm长度，用镊子撕开羊膜（最好从两根动脉之间）一次剔除两根动脉，一根静脉，再用有齿镊子提起胶体，顺脐带轴方向剪成细长条状，再剪成1-3mm小块；# w3 a4 Y7 Y  G
2、酶消化法：消化前将组织块用生理盐水冲洗两遍，剪成肉泥状，转移到50ml离心管中，加入消化 也（组织：消化液=5:3 体积比），混匀，37℃中消化2h，每隔30min振摇一次。加入10倍体积的生理盐水稀释，500r离心3min，取上清液，然后将上清液用2500r，离心10min，取沉淀，将沉淀用Cayden（10%FBS）重悬，将混悬液加入六孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养，次日能在显微镜下观察到贴壁细胞，半量换液后继续培养，3d后换液，细胞能够稳定生长。每三天换液一次，至细胞生长铺满瓶底，即可进行传代。# r: m8 ?) v% c1 T; q
3、组织块培养法：将剪碎的组织块均匀铺于六孔板中，间隔1-3mm即可，倒置六孔板中，放入孵箱1.5h左右取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边缘缓缓加入培养基，注意一定不要将组织块冲起，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，放入培养箱，3d后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现后可以间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。

Diane0321

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非常感谢您的帮助

Diane0321

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5 a  K, ]( f3 t1 ]7 i$ ~% J& @) B不好意思，还要问个问题，Cayden（10%FBS）是指什么啊？是一种培养基吗？我半天也没查出来这是什么，还是要打扰你

smile微微笑笑

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* l- O6 x8 w" |2 i* j% P 真对不起，犯错了，误导你了，是Cyagen （赛业）培养基，一种专门培养间充质干细胞的培养基~

Diane0321

哦哦   没事没事   现在知道了   哈哈    多谢！！！

晗晗

正常足月健康新生儿脐带10cm,两端丝线结扎，浸泡于含DMEM保存瓶中
& o/ I/ r5 M% _1 L' M组织块法：取2~3㎝脐带放入培养皿里剪碎——用PBS或培养液冲洗——然后把脐带转到一个新的培养皿里（尽量把PBS弄干）——然后在组织块上滴加新的培养液（不要加太多也不要加太少不要让组织块漂浮起来）——放入37℃5%CO2孵箱中培养8 ^; @* ~4 N( \9 w* N7 b5 i$ d# x% Z
酶消化法：无菌取脐带2~3㎝——PBS洗涤去除残留血液——剪碎——移至质量分数0.1%胶原酶Ⅳ中，37℃消化18小时时摇过100筛网，收集含细胞的滤液——1200a/min离心，弃上清，保留沉淀，用PBS洗涤2次后，接种在培养瓶中——放入37℃5%CO2孵箱中培养
: R! ~. i! g: E3 m5 `等细胞长得差不多就可以传代啦
& W0 R! h7 [/ @1 x# I$ ^注意：如果是新手还是用组织块法吧，虽然酶消化法快但是如果消化的时间什么的掌握的不好的话就白弄啦，虽然组织块法慢，但是细胞长的比较好，还有就是千万要注意无菌

Diane0321

回复 晗晗 的帖子2 n( i9 N* [% U' |$ _
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嗯嗯  多谢提醒，下次我就试试组织块法