关于PBMC复苏之后絮状物问题

nailute1985

最近在做T细胞扩增实验时候，我D0的时候复苏了一管PBMC，培养到约D2的时候发现培养基中有白色的丝絮状物，镜下观察有大量的细胞被粘连在一起，吹散不开。感觉粘性很强。对培养基中的细胞染色，没有什么死细胞也。我用的是人的cord blood提的PBMC，冻存密度1*10的7，复苏之后接种密度1*10的6/ml，D0天细胞比较正常，D2天细胞就开始粘连在一起了，怀疑是不是有死亡的细胞释放的DNA将细胞缠绕在一起了？还有在D0天复苏之后的PBMC接种到6孔板中镜下观察并未发现类似于血小板或者红细胞之类的那种小黑点点，但是从D2天开始，小黑点点就出来了（不是污染，应该还是血小板或者红细胞之类的，或者是细胞碎片），请教各位有谁遇到过这种情况，怎么处理的？谢谢0 v9 H6 F) Y- V' }  y! Z
图中左下角的孔中可以明显的看到。6 g# i9 V  e- S* |( [8 _/ H
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' s3 e* e& \2 N刚接种时培养基黑点很少
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D2天开始出来
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zhenghua20

PBMC复苏确实是比较困难，一般活率很低，我们暂时也没找到什么好的解决办法。

riverdtang

就是一些细胞碎片，细胞长起的话过一下细胞筛来就好了

nailute1985

回复 riverdtang 的帖子
0 {( {; a( c0 C  p+ }2 |' d; e1 h, k  h* t) L. X" X
嗯，是这样，在PBMC分离完之后直接培养的话，也是会出现这种情况，但是那些应该是血小板或者是红细胞之类的，样子跟这个差不多。复苏之后出现的这些大概就是细胞碎片了吧？但是残留的血小板和红细胞去哪里了？难道是复苏之后洗涤掉了？

nailute1985

回复 zhenghua20 的帖子7 ^5 `, [+ M0 ~% M

) R' R) R( b; C& a' @6 B0 H0 W活率我们这还是可以的，主要看增殖倍数吧。。一般复苏之后前几天，细胞状态都不是很好，过几天挺过来了就行了吧？

我是传奇

挑出来，好奇的话你可以再养，看看到底是什么。

nailute1985

回复 我是传奇 的帖子3 ~% e' T& P, J& N0 y1 |& z

9 W2 ]- P. \2 U$ [死细胞释放的DNA，缠绕了细胞

biluolinyu

缠在一起的细胞，这种情况下细胞基本不会怎么增殖，大约10倍左右吧。PBMC冻存之后复苏活率其实还好，但是增殖倍数也就是冻存前的50%左右 不好客服

fenlichong

首先，刚复苏的PBMC本身可能就有死细胞团，如果分离的白膜层不够纯，死细胞团可能会更多，最好用100um滤网过滤后再使用。其次，不知楼主T细胞扩增用的什么方法，如果是将PBMC用作feeder cell，需要将其进行辐照。

nailute1985

回复 fenlichong 的帖子& E1 _9 d1 F% ]# `/ \6 Q- d9 [
- m, q0 t+ d' Y7 Q
嗯，我们的PBMC提完之后是直接冻存起来的，里面肯定会有些红细胞之类的。然后复苏之后我们也是直接加刺激因子刺激，那些单核或者红细胞，碎片啥的老板说就当作feeder去养，也不影响T细胞的扩增，但是我们没有用辐照。现在的问题是，在D8的时候我计数发现细胞不怎么增殖了，貌似已经到了平台期了，这才8天，一般的T细胞周期是2周左右，而且镜下观察，细胞形态分多样化，而真正T细胞那种体积大的细胞，容易抱团的细胞很少，不知道是不是PBMC复苏之后的原因。