关于PBMC复苏之后絮状物问题

nailute1985

最近在做T细胞扩增实验时候，我D0的时候复苏了一管PBMC，培养到约D2的时候发现培养基中有白色的丝絮状物，镜下观察有大量的细胞被粘连在一起，吹散不开。感觉粘性很强。对培养基中的细胞染色，没有什么死细胞也。我用的是人的cord blood提的PBMC，冻存密度1*10的7，复苏之后接种密度1*10的6/ml，D0天细胞比较正常，D2天细胞就开始粘连在一起了，怀疑是不是有死亡的细胞释放的DNA将细胞缠绕在一起了？还有在D0天复苏之后的PBMC接种到6孔板中镜下观察并未发现类似于血小板或者红细胞之类的那种小黑点点，但是从D2天开始，小黑点点就出来了（不是污染，应该还是血小板或者红细胞之类的，或者是细胞碎片），请教各位有谁遇到过这种情况，怎么处理的？谢谢6 C; Q1 L( L+ H2 ]1 v9 i; X+ ^
图中左下角的孔中可以明显的看到。6 t( ^+ d$ B/ q$ U
  d) S* s  l" w" a3 C
& ]; U! I5 h. o+ p5 v7 z
  C( z; n- `1 e9 s
刚接种时培养基黑点很少, V8 J1 G0 a7 I" m) V0 _

  B/ O' Q1 g- F3 J! I' W/ q0 l* }
$ f. @3 x* |9 n, |" @
1 J& ^; ^+ s" ~, Q  Y4 V" wD2天开始出来
1 D: B. i# v1 Y/ B9 n1 r$ ?! V/ H6 i  B) g4 B

nailute1985

回复 riverdtang 的帖子
9 W6 P! H  K, N$ l" b' V8 t; E) Z& _9 [1 h5 l
嗯，是这样，在PBMC分离完之后直接培养的话，也是会出现这种情况，但是那些应该是血小板或者是红细胞之类的，样子跟这个差不多。复苏之后出现的这些大概就是细胞碎片了吧？但是残留的血小板和红细胞去哪里了？难道是复苏之后洗涤掉了？

nailute1985

回复 zhenghua20 的帖子
  c- a* {" x! a/ s! \; n3 B
; d) \" J- n& w+ f$ y* h* H' Y+ Y& c活率我们这还是可以的，主要看增殖倍数吧。。一般复苏之后前几天，细胞状态都不是很好，过几天挺过来了就行了吧？

nailute1985

回复 我是传奇 的帖子
% ~# J9 ?' {; m
* G1 h8 s3 p0 y  a, [$ i4 y死细胞释放的DNA，缠绕了细胞

nailute1985

回复 fenlichong 的帖子
1 c2 T  i1 n  F5 `$ ]0 x) s/ X  R# q2 c' d" R0 M3 G4 f
嗯，我们的PBMC提完之后是直接冻存起来的，里面肯定会有些红细胞之类的。然后复苏之后我们也是直接加刺激因子刺激，那些单核或者红细胞，碎片啥的老板说就当作feeder去养，也不影响T细胞的扩增，但是我们没有用辐照。现在的问题是，在D8的时候我计数发现细胞不怎么增殖了，貌似已经到了平台期了，这才8天，一般的T细胞周期是2周左右，而且镜下观察，细胞形态分多样化，而真正T细胞那种体积大的细胞，容易抱团的细胞很少，不知道是不是PBMC复苏之后的原因。

nailute1985

回复 biluolinyu 的帖子8 U, T. D, t3 n8 K; x+ s, ?0 J
# q& w4 g: W; V: x- [8 f: p
您说的增殖倍数是冻存之间的50% 也就才是1.5倍的增殖么？您有做过这方面的验证实验吗？

nailute1985

回复 why77yhw 的帖子
' s3 c, C& o5 D5 N& n/ q% a; I0 }7 z8 x7 O) I; S+ D% v
因为我们是小体系培养，转袋的话不方便。

nailute1985

回复 biluolinyu 的帖子5 v' Y& s0 {8 y1 o1 ~

0 W1 f6 o% J5 `* I0 V6 {3 y对，还有，您说的PBMC扩增倍数百倍的话，是指的所有细胞数对吧？不是单纯的T细胞，因为现在我在养PBMC的，已经D8天了，T细胞那种形态的比较少，都是比T细胞小的细胞，如果算扩增倍数的话，这部分细胞需要算进去嘛？

nailute1985

回复 why77yhw 的帖子
1 q7 {( L. r1 ?6 N# O/ f1 x9 U5 Y$ z3 ~9 C+ l( {$ j% s* |$ t
我们培养体系就是用的白蛋白，按照您的方法，您把上层悬浮的细胞吸出去之后充分吹打的话，我觉得还是吹散不开，毕竟是DNA粘连在一起的。我的做法就是那种丝状的东西我就直接挑出来，虽然会损失细胞，但是后期会好很多。