CAR-T的相关检测

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：: M6 P! f+ r+ R8 b( L
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；
5 c- a4 |7 m8 {' _3 m2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。9 g6 a5 D" [4 ^5 E

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补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

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弱弱的问下：
2 c. ~9 ?# E9 Z6 Z  G8 w7 J1 s+ Z1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？
9 H) d: ]) J* p3 r# H3 u! z. z2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。1 L; q" X' i& P/ k0 G5 u
3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

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  K3 y- G. D1 j7 x4 s# {回复 ET生物人 的帖子7 }9 r" h' O6 h# y. I+ `$ |" W
' V* D3 {5 z3 d9 e
间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。
" X( l0 ]4 o+ |. m: N你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。* w9 ?# X& L* f+ `: \
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。

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临床试验还可以标记荧光素？你是准备做个绿巨人出来？

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回复 quanquan326 的帖子4 G3 }% @) G, w4 {$ I

$ L1 g; G' H4 e/ d+ U0 |: t流式针对细胞内蛋白的检测，都是先打孔，然后标记抗体，算比较成熟的方法了。你可以查下，有专门的试剂。