CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：' A$ H% o/ D# G  G; C' j: G# \
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；" a& r) e" {6 ]8 q
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。
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luoye1986

haosenna，给你顶一下

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; q9 E9 b2 X$ r' g
补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

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你是谁！！！

ET生物人

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% r) o, n! Q# ~4 b8 A
一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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$ V2 P( D) ^* C  r% z9 m4 ~7 v弱弱的问下：2 y) P6 V1 j3 f1 Q; g
1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？7 I& |1 v$ t; i1 f! @
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
1 y$ B/ }9 L% {# Q3 X3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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额。。
, R' [& l- C8 Z7 ]; q- E# y7 V; y1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取
" i  H8 i; s4 v( u* D5 u1 y% i& d, V2、细胞打孔标记检测没听过这个方法
; v5 ], b. a9 d6 u0 C' Y1 S( B1 H3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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& x4 _' f2 a; X5 Y2 d回复 ET生物人 的帖子
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# M7 I# _. [: }间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。' }$ J# p2 {& e, B2 T
你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。( W# m+ `6 t# n2 S& Z* J
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。