CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：  k0 P+ }( X( x" X- D* c& r1 s
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；0 c  Y2 L( `! D9 a; c+ A2 Z1 P
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。
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luoye1986

haosenna，给你顶一下

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回复 随时准备下线 的帖子5 R1 v. r6 Z+ @1 |: X5 _1 }

  d- `  b9 v  R补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

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你是谁！！！

ET生物人

回复 随时准备下线 的帖子6 f) s& T# S* F# q
/ z# i1 A& U3 L/ X
一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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回复 ET生物人 的帖子  g9 O. f7 \* _5 v$ J/ i0 Y
% w* D+ z# |' \8 J
弱弱的问下：
9 Z" L; E% x2 E# {* U% r9 q) r1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？& ]/ n0 Z4 e5 D4 R, d
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
. S% K# s" ]! m6 y, ^3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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' q$ o& l5 B* i: s! |8 S( L
额。。1 _4 y" `7 i! e1 G
1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取
/ @: w0 ~. L. ?! d* X2 l9 s2、细胞打孔标记检测没听过这个方法
3 F1 D! o# k) N( R3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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+ T; _2 j$ u$ R2 a3 a间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。
' D% k5 L% B% X你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。
, M" d5 K& N8 Z6 K+ W这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。