CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：# M; o0 g2 ]  ?, M8 Y3 @
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；5 D2 F; J# K5 V6 J: p8 G1 w4 d
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。, K# a2 _6 A) M$ v9 I9 Q8 z

luoye1986

haosenna，给你顶一下

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回复 随时准备下线 的帖子$ b. f5 f( o0 u2 K4 v& l9 M' t' Z8 b
4 |; T8 C8 a  C1 L5 i
补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

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: f8 Q: N9 W" R2 W: [$ k2 ]1 z5 L' U$ P. G- k* s7 Q
你是谁！！！

ET生物人

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; l$ S2 K, [+ ]7 T! f: K% u一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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4 s! k7 w  |6 G/ r) K4 J; V/ c/ M
弱弱的问下：0 a; i9 H( Z' d, R) k$ q; C9 ~1 B# w
1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？5 Q7 D# X) |: ]) Z
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
+ V+ Z9 R$ Q* N& V- e/ ^3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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  ?0 i# d: |, M" |1 N' @4 N" @9 `, D; U7 E8 B4 u) A0 x: d2 s# p
额。。
0 F' q+ V! F1 M# ^9 w, m: w: j' n/ |1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取) K/ G! z  ]# ?% @1 i
2、细胞打孔标记检测没听过这个方法% h# @& d( X: K, I( k8 D
3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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5 |) R( f# q% }6 y7 S: ~: P
4 T6 [; P$ H% w; X9 J+ v) }回复 ET生物人 的帖子
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5 X+ C9 B9 B; G7 m1 d6 B* E间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。# K1 l. ~& _! u
你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。% |( }4 |% x1 D: k0 M6 B7 q+ v- d
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。