CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：' ^& b2 W& w! {; \
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；% N+ c& Y+ m" C
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。
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luoye1986

haosenna，给你顶一下

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补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

回复 luoye1986 的帖子$ \1 h# \: y! O$ `
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你是谁！！！

ET生物人

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一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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弱弱的问下：) a% C. |" y2 I! W0 E8 h
1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？# v7 U, p' g+ C, H/ d/ U
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。7 A( X6 p  d- E- C
3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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额。。
4 F: R' P$ _0 H7 R1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取
! E. F# {5 a8 |2、细胞打孔标记检测没听过这个方法
) \7 ~) T' W# K$ m. ^' z3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。
5 [/ f" K; F) V' U3 |- T你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。( R8 t, P. |2 T2 Q- \& m( `
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。