CAR-T研发及产业化浅谈

842195369

CAR-T研发及产业化浅谈5 m1 U, ?- Z# J. ]2 T6 q$ m
2016-07-03 罗正强 贝壳社
! w- l  l3 t' C/ U8 \+ `. _5 i) I) Z) Q8 Q4 V, s8 r' q
嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）技术，经过十几年的发展，现在已经发展到了可以成熟应用到B系白血病或淋巴瘤等的试验性临床治疗方面，并且一些产品获得了惊人的应答率，如诺华的CTL019在临床试验中达到93%的客观缓解率。全球医药行业和金融资本对这一技术争相追捧，国内外众多以此技术“白手起家”的小型初创公司大获资本青睐，如美国的JUNO和KITE公司，两家只有20名左右员工的CAR-T研发制备公司，在临床一期实验之后就获得了不菲的融资和金融市场反馈。
4 A& f" |3 F2 u* Q6 J8 ?$ _  z
6 P4 \5 r4 x: F+ F  Q* H1 h% n9 B( {8 `' K
而在我国，CAR-T研发和产业化虽然起步较晚，但还是看到近两年不断有医院和生物技术公司报道较为喜人的临床试验结果（至今注册的临床试验项目已有33项之多，紧随美国的54项），如解放军301医院韩为东教授（9项）、西南医院钱程教授（2项）、博生吉医药科技有限公司杨林教授（2项）、仁济医院李宗海教授（2项）、上海细胞治疗工程技术研究中心钱其军教授（1）项等。
' d3 g/ s' I9 ^" [5 n  ^: }  X' n$ A8 Y" H2 A9 N
- j% X5 E3 W5 N+ j, W( h
在国内从事CAR-T研发与制备的公司中，与解放军总医院301医院生物治疗科主任韩为东教授合作的西比曼公司走在前列，公司于2014年6月18日正式在美国纳斯达克挂牌上市（股票代码：CBMG），成为唯一在美国纳斯达克上市的中国细胞生物医药科技公司。该公司目前进行了多项针对不同靶点的CAR-T临床试验，如CD19、DC20、CD30、EGFR等，均取得了较好疗效，而针对实体瘤的CBM-EGFR.1在实体瘤临床上取得较好疗效，也证明其在CAR-T实体瘤治疗领域处于国内乃至世界领先水平。
* d# Z' E2 l8 l0 P3 Y0 g
; O3 [/ l6 q; y  b5 o& r/ o
1 s8 z1 D( G; w( Z0 ?9 _. P另外，上海细胞治疗工程技术研究中心集团具有一定代表性，其拥有成熟的免疫细胞治疗研发和产业化相关技术平台、精准医疗指导下的全产业链免疫细胞治疗和健康管理等平台。到目前以来，已经拥有了40余项免疫细胞治疗相关专利，其中12项关键技术被国家专利产权保护部门认为涉及到国家重大战略利益需要进行保密审查，其CAR-T研发和产业化方面，靶点不仅仅在血液肿瘤（CD19等），更逐渐拓展到实体瘤方面，如HER2、Mesothelin、EGFR、MUC I等，并且在临床试验中取得了较好的治疗效果，多项临床试验正在进行中。该公司于今年4月份获得了1.3亿人民币的B轮融资，公司估值达到8.3亿元人民币之多。
2 f( k5 k# g# }1 Z; V9 b
; |* P2 r! M/ R. H- ?: \6 q0 y8 O3 K' T6 q1 `% F# T
而除此之外，国内的诸多CAR-T研发和产业化相关企业中，艺妙神州的建立就是一个“白手起家”的典型案例。于2015年清华大学博士毕业、做癌症生物学相关方向研究的何霆，和两位分别做临床药物设计和免疫学研究的同学，从2014年下半年开始进行研究，至2015年6月毕业，创办了北京艺妙神州医疗科技有限公司，拥有7项专利，并拿到500万元的天使投资，并由于一例临床患者的良好治疗效果，于2015年12月份，进一步拿到1000万人民币的preA轮融资。" `4 Y/ ^# I/ j1 C# [0 p
/ n# U2 m8 s, _
) d$ G0 F# M7 F. R1 x! e; D  s
那么，CAR-T到底是什么技术这样具有魅力？它的前景如何？中美之间CAR-T研发和产业化之间有哪些异同？让我们从CAR-T基本结构演化、目前面临的挑战、中美之间CAR-T研发及产业化对比、今后的研发和产业化方向这四个方面对这一技术进行一个全面了解。1 `2 {' p3 [" m& a; p
; B5 u0 ]% y) x
一、CAR-T基本结构的演化
. f/ V& J/ n0 i8 m& [4 y6 M& Y0 Z. T  i  Y! k
# v: y% |  w+ ~2 t3 _0 h. }* f
经过不断试错（初期一代CAR-T的无法有效激活及维持）和从教训（早期临床试验中几例病人的致死）中吸取经验，CAR-T的结构随着T细胞免疫激活双信号机制的基础研究发现等的逐渐进步，从只携带有CD3ζ胞内激活结构域的一代CAR，逐渐演化到携带CD28/4-1BB/OX40/ICOS等胞内共刺激结构域和CD3ζ胞内激活结构域的二代CAR（携带一个共刺激结构域），三代CAR（携带两个共刺激结构域）。4 q) K# S* [: \

0 e  Z4 y& ]8 P' @  f0 M( M% J, |. N
# I6 [/ ], [0 d6 ^) }: A  B, J并且，基于对安全性的进一步研究和突破，如应对细胞因子风暴时，诺华的CAR-T团队采用IL-6抑制剂即可有效降低和解除该副作用，这一结构现在已经开始成功应用到临床试验，并且在针对CD19抗原或CD20抗原等的B系淋巴细胞白血病等的临床试验中取得了惊人疗效，而应用二/三代CAR结构的针对其他靶点的CAR-T细胞，也在黑色素瘤、前列腺癌、头颈部癌症、肺癌等中进行临床试验。
+ i" j2 [/ K* p0 h4 M, ~' |  v% M7 i0 E+ [% B. d1 l

. _1 k' i! j/ ^面对实体瘤高异质性、肿瘤相关抗原（TAA）特异性不高导致脱靶效应（on target/off tumour）等方面问题，实验室研究中的一些报道，采用了双信号CAR结构，该结构采用两个独立的CAR结构，将提供T细胞激活的第一信号CD3ζ胞内结构域，和提供第二信号的共刺激受体CD28/4-1BB/OX40等的胞内信号结构域分开，分别连接至两个独立的CAR结构胞内，胞外采用两个靶向不同TAA的单链抗体（ScFv），取得了一定的针对实体瘤动物模型治疗效果，并有效防止了脱靶效应。
5 r. S( |" p4 `3 l, R7 m; S& k% e( Y( x

% p2 G- o' }, ?+ f& I) e8 ?在此结构基础上，一些团队还进行了对胞外单链抗体的优化，分别使两个单链抗体拥有不同的针对TAA的亲和力，如对提供第一信号的CAR使用低亲和力，而对提供共刺激作用的CAR采用较高亲和力，这样能够在一定程度上提高防脱靶作用。另外，也有团队尝试进行了称为iCAR的设计，将提供免疫抑制信号的PD-1受体的胞内段信号结构域，连接到携带针对正常细胞抗原ScFv的CAR上，与靶向TAA的二代或三代CAR组成双信号受体结构，在动物模型中能够有效避免对正常组织的副作用。
1 v# t% z2 u& H5 j6 X. M6 W5 q4 P' {4 \1 @# O( q, n
' Y: [7 `6 p' G+ O
在面对实体瘤由于PD-L1高表达而导致的免疫抑制方面，最近也有团队在上述双信号独立CAR结构基础上，将PD-1受体的胞内抑制性结构基序替换成CD28分子的胞内激活结构域，与靶向TAA的二代CAR组成双信号受体共同表达，使这一新嵌合受体与T细胞原本的PD-1受体竞争性结合PD-L1从而扭转免疫抑制，从而能够提高CAR-T对实体瘤的杀伤作用。# p5 I/ z1 m* G) _- {: A. X+ D; C
) M# h( m, ]3 A! Y
) b3 _# K8 }# l; Q* N
此外，尚在临床前实验阶段的CAR结构，有在二/三代CAR基础上，在CAR的基因表达框内同时携带独立组成型表达或诱导型表达的免疫调控因子基因，如IL-12/IL15/anti-PD-1等，将其称之为第四代CAR，这样的结构能够在针对实体瘤时，面对其微环境的免疫抑制和实体瘤高异质性方面发挥一定的促进杀伤作用。
5 |4 ~5 Q% K6 ~5 |2 H" ?7 |" O& P: J! f: d, g) A7 }% A

! v4 l0 A. M" P/ h而面对有些由于身体原因以及经过多次放化疗导致免疫细胞活性很差，从而不适宜进自体CAR-T治疗的患者，通用型CAR-T（universal-CAR-T,uCAR-T）无疑是最佳选择，业内将其称之为第五代CAR-T这方面已见报道的有Cellectis公司2013年的科研论文及其近期对一例幼儿白血病患者治愈的报道。近期，我们也可以看到Baxalta公司与基因编辑公司Precision BioSciences宣布达成合作，开发基于健康供体T细胞的新型嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)，以用于多种癌症的治疗。2 U( o, u2 z4 y! ~2 W& t

4 Z: e# g! P) e5 j3 f! M5 {; G$ u  [
所以，CAR-T结构的演化，逐渐在解决其面对的问题中前进，至今已经演进至五代CAR结构，而临床试验应用中多以二/三代CAR结构为主，其他CAR结构还需要进行更多的优化和提高以应对临床实际应用中对疗效和安全性的要求。目前临床中应用的靶点总结如下：
: r$ n% L  X6 J" t, x* a5 E8 U( Q# a& P
" q1 p4 r4 [4 s% O, _
, l% V; z5 r6 V
（图片来源于网络）
, j/ X0 o/ _# Q5 Z! }9 V: ?$ R# W7 _1 z' ]9 S
二、目前CAR-T研发和产业化中面临的问题+ q0 q4 v9 S- P% `6 X$ Y- V! v, _

9 x. \# G3 C) e+ D/ P9 z: ]& ^& m2 J: _
从目前CAR-T的临床前实验研究结果和临床应用方面来看，遇到的问题主要分为以下几个方面：
; H% H( N+ H3 o, d) j+ x; C/ f2 `7 I# V; u' U+ L8 ^, G) e7 }

( f" o3 v1 z% d/ _, i" s1、靶标抗原的选择及其靶向问题。! s9 }& }) O$ A, G. \

7 W+ A: M2 Y) r/ I; v) |7 X3 t
  F# q1 ~4 B$ B* b# Q! k4 \由于CAR-T使用其胞外单链抗体进行对肿瘤细胞表面相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）的靶向结合，进而通过其胞内结构域激活T细胞进行对肿瘤细胞的靶向杀伤，所以靶标抗原的选择对于这一特异性杀伤作用至关重要。而由于肿瘤细胞表面很难有TSA可供利用（CD19的特异性表达也是CAR-T在B系白血病和淋巴瘤等治疗方面如此成功的一个因素），导致一系列靶向TAA的CAR-T因为脱靶效应而出现严重副作用，典型的如靶向HER2的临床实验失败案例。所以现在急需要找到和开发更多可供利用的肿瘤特异性抗原。这方面，笔者所在团队设计的精准医疗指导下的肿瘤基因突变新抗原全人源化抗体匹配筛选系统，通过创新设计的筛选方法和抗体Fab库建立方法，有望能够发现更多可用的肿瘤特异性新抗原。& ]3 }0 k, {, k
5 C% B* D" H2 G, k, R# X. k

6 j) t% a" ~, U1 T而针对TSA/TAA的有效靶向问题，需要根据不同的抗原表达情况和癌种的不同，选择不同的ScFv，例如，针对NY-ESO/CD19等特异性较高的抗原，可以采用高亲和力ScFv实现对CAR提供较强的结合力从而使其更迅速地激活启动的杀伤，而对于肿瘤特异性调高表达的TAA，适宜采用中等亲和力的ScFv以实现降低脱靶作用等副作用的发生。另外，针对微环境形成较为紧密和“顽固”的实体瘤，采用特殊策略辅助ScFv提高靶向性和免疫突触有效形成，将有助于CAR-T更好地发挥杀伤作用，与此同时，目前的双信号独立的CAR-T结构或者双特异性CAR-T结构，都需要在这一方面做一定改进和考虑。
/ m  ?+ C1 g) L# b, U% u. ~1 r' R2 u6 U; I+ Y
4 ^1 h' M+ J% J: R2 b: n8 S- D
2、胞外单链抗体的人源化问题
4 v+ E: R4 C9 h
3 A0 }# ]% ]9 v( h. ~) }
1 o/ A: J; g2 b, f* G+ ?0 e) g目前，临床应用中的CAR-T治疗已经明显证明，采用鼠源性的胞外单链抗体序列将导致CAR-T回输至患者体内后很快因为免疫原性而导致免疫排斥和清除，这是导致部分临床试验效果较差的原因。所以今后对胞外单链抗体进行人源化改造，或者直接采用全人源化抗体库筛选靶点进行匹配，从而依托精准医疗方案指导CAR-T应对更多特异性靶点，以及提高体内疗效，将是一个趋势。
2 K% p0 d: M. W! J' d$ u8 X2 ~9 e) k' k% K8 W4 T* C' n4 a
$ [# E! t) b* T, ~$ ]
3、T细胞基因修饰问题7 a% N6 N/ J+ H# w# F
4 n4 `( a: N6 E3 [- {
0 B0 W4 a- r$ e/ r8 A
目前制备CAR-T，对于T细胞进行CAR基因修饰，采用较多的载体为慢病毒载体/逆转录病毒载体，其次为电穿孔载体等。这些载体，在进行基因修饰的时候都面临是否进行整合型修饰、整合位点选择、修饰过程对T细胞的损伤、修饰效率提高等问题，这些技术问题在初始研发CAR-T过程中是比较重要，成熟以后可以直接应用于针对多种靶标的CAR-T。; H( S. \  M, k8 l1 G1 U
9 S" _* X& O2 x1 {4 k; a

4 z5 N5 X8 i" I/ Q首先我们来聊聊修饰方面方面的整合问题。是否进行整合型修饰以及整合位点选择，要与修饰前所选择的T细胞类群、所治疗的肿瘤类型及选择的TAA特异性高低进行权衡，因为整合位点选择不当或非整合性修饰而导致的CAR丢失，将导致CAR-T过早失去功能，这对于较顽固的肿瘤治疗不利；而整合型修饰结合修饰前T细胞亚群选择导致记忆性CAR-T的形成，这在一方面能够有效防止复发，但是这仅仅限于选择的TAA/TSA特异性较高的情况下才有利，否则将导致副作用的长期存在，如针对B细胞白血病一类的CD19-CAR-T，形成记忆性CAR-T长期存在于患者体内将极大地不利于患者的健康，因为这将导致患者长期的B细胞发育不健全，而这一情况还是比较好的，如果是针对实体瘤的TAA，如果该TAA在正常组织或者器官表达，将长期存留发生严重副作用的可能。5 _- z, S! G+ y6 W2 F
) h$ k! ~, v6 c! e% S
" _" q! q* `( ?4 R4 f5 q0 V5 ?
另外，整合型修饰中整合位点是否导致突变产生，从而导致修饰后T细胞出现坏死、失能等，都是需要解决的问题，所以在整合修饰载体的插入位点方面，需要进行一定研究，最好能够使其定点整合，而对于选择靶点特异性不高的肿瘤进行治疗时，应考虑进行瞬时转染、少量多次治疗。另外，在CRISPER/cas9或者TALEN技术结合应用的情况下，可考虑进行通用型CAR-TZ制备中TCR定点敲除的同时加入特定位点，后期进行CAR的定点嵌入修饰。% Z/ U' B, |8 k! ]. ^, l$ y

! s+ m+ k3 k, u' y' z4 l, g, N: X* Q9 M, m. A' w$ v
然后，再来谈谈关于修饰过程中对T细胞的损伤问题。对于慢病毒载体、逆转录病毒载体等，转染时对T细胞的损伤较电穿孔载体轻，这也在一定程度上取决于病毒类载体结构设计、制备方法、转染前T细胞状态等，而电穿孔载体对于T细胞的损伤是无法避免的，唯一能做的就是想办法将其降到最低，这方面可以根据载体大小、T细胞状态等情况优化电转条件，载体中添加入核引导序列、根据不同T细胞亚群改进PB/SB载体结构等。这方面，笔者所在团队设计的新型电穿孔载体结合优化后的电转条件，将有望能够很好地降低损伤和提高修饰效率问题。
4 Q% z5 E1 m& v% A& L
- c) J  f: Z: R5 e3 n. L& B, u! j: e2 E& s4 m5 |# K
修饰效率方面的问题，在添加特异性修饰筛选标签或者结合CAR特异性磁珠筛选富集，后期进行CAR特异性刺激激活和增殖，在修饰前分选并短期激活的T细胞量达到108的情况下，则只需要修饰效率达到30%以上即可满足要求。当然，为了实现短期制备细胞要求，在后期特异性诱导增殖方面尽量缩短时间，达到6-8天制备得到临床需求量和状态，则需要将修饰效率提高至50%以上。
: D; [# G7 k$ D4 R( K- _( q. g" h: u+ e8 e1 L( a9 e' W, V1 |4 g6 L, [7 h. _0 H

; x* d; y  W; u4、T细胞修饰前细胞亚群的选择问题5 `: |6 W* G, K9 {' B- i) Y
2 o9 b" ]3 V* s5 q2 j+ s8 E4 }; U
( G, ~1 R2 t! \0 n2 p1 y/ a0 P  E1 g
基因修饰前细胞亚群的选择问题，直接决定了后续治疗效果的差异，单纯选择CD4+T细胞或者CD8+T细胞都不能提供有效地杀伤，而直接对PBMC进行修饰，将同时对其中的Treg细胞等发挥抑制性作用的细胞进行CAR修饰，这对于实体瘤的治疗是不利的。所以在基因修饰前进行的T细胞分选中，需要进行优化选择合适的细胞亚群比例，以及优化分选手段降低对细胞的损伤。在CAR-T针对实体瘤的治疗中，由于实体瘤庞大的细胞数量和免疫抑制情况，修饰前细胞亚群选择这一方面，还需要根据针对不同癌种和不同修饰载体、TAA特异性高低等情况进行进一步摸索和优化。
! ~, f4 ?! l6 t0 h7 p. @; f6 w$ j/ K  F8 J* V" Q

7 J$ p1 P! }( ?4 L% C5 Z4 Q5、CAR-T细胞的培养和分选问题* I! ~* e/ w9 Z# b# z' K6 p
7 _' U+ h6 L% D* k# ^& v8 o7 n

* O& Q; ?6 v  \4 y如何进行对CAR-T细胞经过基因修饰之后的进一步激活和培养，将对其回输后的疗效产生显著影响。而如果采用与普通的CIK细胞刺激培养方法一样的方法，将导致CD3/CD28集簇按照T细胞本来方式形成，以及以本方式激活之后导致抑制性受体的调高表达，从而导致CAR结构无法在回输后有效形成免疫效应结构，进而影响治疗效果。所以，单独对CAR的激活和后期采用对CAR的分选，将显著影响CAR-T的疗效。这一问题，目前还需要进行更多研究和观察，因为很多开发者进行的该方面工作并不能保证CAR的有效修饰和培养激活，所以目前得到的临床试验结果以及正在进行的临床试验，还不能够深入到这一块对临床效果影响方面的研究。另外，分选方法方面，如何有效降低对CAR-T细胞的损伤也是至关重要的。
4 H# u3 e3 @2 [
: s$ M! j9 d& u/ _7 i) s& g$ K5 ^5 l1 W% u8 M7 x
6、实体瘤免疫抑制问题  M2 }+ ?2 i; c$ l
5 k! e  Q$ u4 Z% c! Y, p" w

' h% L4 J& D6 V7 `; h8 \. m* B4 a实体瘤由于其具有的免疫抑制微环境、瘤体聚集紧密等原因导致免疫细胞治疗对其疗效不佳，目前CAR-T也面临同样的问题。我们可以采用PD-1/PD-L1抗体和CTLA-4抗体，将其与CAR-T协同进行治疗，但是这样的治疗还是会受限于这一类免疫检查点抑制剂的部分系统性副反应。这方面，目前有研究者尝试采用CAR-T同时携带胞内表达抗PD-1/PD-L1抗体，突破实体瘤免疫抑制的同时降低副反应，但这样的手段需要开发一种较高效的基因表达载体和表达调控策略。
5 |/ I# S; z# L" B  A
" L5 J6 g9 o" d  G$ r  K6 Z, Z( m' B' Z" G. y+ T
可喜的是，上海细胞治疗工程技术研究中心集团正在尝试进行这一方法的产业化工作，并取得了较好的初步临床试验效果。而除了这些检查点导致的免疫抑制外，肿瘤微环境中还有的IDO、肿瘤低氧酸性微环境特征、糖代谢竞争等，都是免疫限制因素，这些方面综合起来，都需要开发一些相应的方法进行进一步的CAR-T自身的调控或者与相关制剂的协同治疗。这方面，笔者所在团队正在开发的新型实体瘤特异性CAR结构，将有望能够依靠新型CAR结构内部特殊的信号结构而突破T细胞免疫抑制信号的胞内传递，以及突破实体瘤有氧糖酵解导致微环境缺乏葡萄糖而导致CAR-T细胞免疫信号传递失能问题。4 M  r7 o9 F1 j5 X( A+ M
( [/ O4 l/ C3 w' c* }1 O3 `" @
' R9 A- C# Y8 U2 c4 e/ t
另外，大多数实体瘤，如胰腺癌、肝癌、胃癌等，与血液系统肿瘤相比，都具有瘤体聚集紧密、内部血管深入不足等问题，这导致CAR-T细胞无法有效趋化至肿瘤灶、无法深入瘤体内部以及瘤体内失能等问题，这方面需要进一步研究策略予以解决。4 x1 J) e, Y1 G$ B; o( q
2 I4 I' \9 }$ Q: P! }

) J1 o  V1 C2 @$ r! I7、复发问题
! I/ P9 y# l$ V5 C& l3 M5 ^6 u# g
7 e' [% G6 r  |6 k$ B
. L' o& q0 D% p1 p" `6 Q虽然CAR-T在血液系统B系白血病方面应用，能够有效清除肿瘤细胞，但是随着CAR-T细胞在血液中的衰亡、CAR丢失或靶抗原突变等原因，其中也有许多患者在肿瘤清除后一段时间后出现复发，所以这一问题是不得不面对的。现在，根据不同的复发情况，一般采用的方法是继续回输、结合放化疗或者靶抗原更换。; j$ L8 A- N& R

& Y, E3 q% `! E5 P4 c2 W: w0 H% S6 ?
8、安全性问题
' ]) f- ^5 h0 L7 w6 ?1 T. z
: q  I  v+ ~/ g1 K6 L  E/ a4 i% I6 M7 {0 d. |( \7 P
安全性问题，尤其是CRS问题，是CAR-T临床应用中不得不面对的一个重要问题，这方面，在靶点选择、胞外单链抗体亲和力选择、回输细胞量、回输后病人体征监控、IL-6抑制剂等抗CRS药物使用时机/剂量、刹车系统启动时机等都需要根据不同癌种、病人特征、不同癌症负荷等方面根据临床试验进行摸索优化。
2 \1 n% [  i. i4 x' w) K
  p9 g- E' i9 j  I! m, q
) s3 p9 D6 N. {2 v9 y9、产业化制备及政策
' c, ?% E8 V/ x5 A. d) @# L* A, I( G
- N0 V) o- S. G0 T( E
产业化制备方面，需要对T细胞分选、CAR-基因修饰、培养、回输前质检等方面建立完备的技术标准，在相应的流程和岗位建立SOP和配备专业的操作人员及设备、建立相应符合要求的细胞制备环境。另外，由于目前归属于自体细胞治疗技术，现行政策急需明确CAR-T今后发展路径，即按照药物进行开发和监管还是按照临床技术进行，这将对于CAR-T在国内的今后发展影响甚大。而对于多区域制备中心的建立，笔者认为目前为时尚早，需要进一步明确国家和地方政策。) h1 A0 Y7 b8 W
9 a/ M" n7 E6 {- {/ E6 c$ F: b
三、中美之间CAR-T研发及产业化对比; M. r5 R$ T4 T2 W+ k
' r5 ~# I1 G6 _# ?
: P$ o& v, r& M/ R- f& N" t
1、研发方面，美国遥遥领先中国3 D/ l' Q# @: ]
" R( U. \, {- p, R  N* D9 z  T0 N

9 `, e/ l  ^# Z, R通过对中美之间的CAR-T研发相关专利和文献的对比，我们可以发现，美国作为CAR-T技术的发源地，在这一技术的研发方面远远领先中国，包括CAR-T结构方面的专利数量、结构的创新性方面以及CAR-T基本机制等的创新性研究方面，基因修饰载体方面研究，细胞培养等等方面。而反观国内，大部分专利和研究文献都是停留在更换靶点，对美国公布的CAR结构的局部创新性改进和优化等；可喜的是，虽然如此，也难得有一些专注于肿瘤免疫细胞治疗方面的生物技术公司和科研单位做出了卓越的创新性研究，如上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司，就拥有多项自主研发的新型CAR结构、基因修饰技术、细胞培养技术等方面的专利，这些原创性的工作对于中国的CAR-T后期发展和实现弯道超车都是有很大意义的。
) m6 L  i/ w6 c0 f: X5 e
2 I% n3 u6 D0 G: U( d- V* \! i3 z# g; v

* [* _  L% L! `* p& t1 a4 G# X6 W* O9 D( j9 a6 s3 ~
（图引自搜狐）3 s$ f' n4 [9 J- s6 k

# W2 j) v" y: j, @9 W
5 w3 {" D5 X! U2、产业化方面，中国正在奋力追赶
4 r& z" A2 P$ o/ z: F" A) ~' j* R4 W  t& e1 O
$ l& I. r( c1 N4 [* v9 N# c
从近两年的CAR-T有关的产业化新闻报道方面，我们可以看到，美国由于研发技术、资本投资环境、产业化高效、政策环境等方面的领先，出现了诸如JUNO、KITE等微小型技术性初创企业迅速崛起，并获得资本追逐，而另外一些医药巨头，如诺华等公司投入大量财力与技术拥有者宾夕法尼亚大学的Carl June教授团队合作，迅速领先，预计其CTL019能够在2017年获批上市，这已经领先其他团队。+ n* z% Y$ E3 P% |3 k7 T
* }; w- B- i0 B+ V# J$ [0 j

% s8 N( J% O5 E但是由于CAR-T具有技术极强的属性，其他团队和公司也展现出极大的追赶力度，而中国由于研发人员和医药产业界的积极合作，在CAR-T的产业化合作和开发中展现出良好的发展势头，如2015年2月9日，中国解放军总医院（301医院）与美国生物制药公司Cellular Biomedicine（CBMG）达成协议，由后者收购了前者的CAR-T细胞疗法的海外生产和销售权，这项收购包括CD19、CD20、CD30、以及人表皮生长因子受体（EGFR）重组表达载体等免疫技术，已有的临床I/II期结果、相关专利的所有权、以及生产技术。9 p( ^" D5 m. |

1 }0 v+ x  D1 S9 ^2 v- |8 n2 u5 z0 G4 S% b6 R# d+ x) _9 t, ^
而2016年4月11日，中源协和发布公告称，该公司拟以自有资金5,800万元购买中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）（以下简称“血研所”）拥有的两项CAR-T专有技术及依托于该技术申请的相关专利。除了这两大宗专利交易，中国的许多拥有基本的免疫细胞技术研发能力的生物技术公司与一些医院、科研单位紧密合作，也在这一技术的产业化方面做出了许多成绩，如西比曼公司，与北京301医院的韩卫东教授团队合作开发的一系列靶点的CAR-T技术，已经成功推进到了I/II期临床试验，其他如博生吉医药科技有限公司杨林教授（2项）、仁济医院李宗海教授（2项）、上海细胞治疗工程技术研究中心钱其军教授（1）项等，也都在紧锣密鼓地推进临床试验和进一步的研发工作，相信如果政策方面有利于该技术的进一步产业化和临床应用，以及出现更多的创新性技术，我们国内的CAR-T产业化和临床方面存在弯道超车的可能。
7 K( n- F4 K' v9 O7 R( T1 d& |: \* F" W5 G8 o9 [6 F$ B
四、今后的研发和产业化方向6 s$ m, {0 [" a- `- t% v" O
# E6 B0 h- t5 z8 F$ {, j; O/ A

, P6 m+ D$ C& Q! k, ]从以上的CAR-T基本演化、遇到的问题和挑战以及中美之间研发和产业化之间的对比，我们可以得出，CAR-T这一技术在今后的研发和产业化发展方向，至少在中国的发展方向，可能在以下方面存在技术突破：
# p1 M, R4 y# c- J. o' u8 V* O2 x4 o! U( p+ k$ {
" y; S9 z' _( n/ p7 S& F
1、通用型CAR-T产品
) O% y8 M+ U- q# e
, `1 o* {' O6 k+ U/ C8 G+ ?' u2 K
9 Z7 D$ g3 S9 K2 T1 FCAR-T，其前期发展作为一种免疫细胞治疗技术，得益于其天然具有的免疫杀伤作用和后天经过改造赋予的靶向识别优势，其经过自体细胞的基因修饰培养激活后经过回输，如今的技术，已经能够使其作为一种的活的药物，对特定的肿瘤病人带来生存希望和极大地改善生活质量，减少类似于放化疗因治疗所遭受的痛苦。3 d" O1 i& Y$ ]8 h% I& j

9 [! q. ], T( ]2 D* K/ z7 L! J1 ?/ K+ C2 x, U& }/ b' \- v2 N
而与此同时，因受限于免疫系统自身的某些限制性因素，如异体回输时由于免疫原性等原因导致的免疫排斥、移植物抗宿主反应（GVHD）等，这将限制该技术广泛性和便捷性应用，同时也在一定程度上提高了该技术的成本，另外，对于一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者，其自体的T细胞是不适合制备CAR-T进行肿瘤治疗的。所以，通用型CAR-T技术将是今后的一个方向，在基因编辑技术如CRISPER-Cas9等的进步下，如果能够实现对健康供体来源的T细胞TCR及其他导致不同个体间免疫原性的基因的敲除，将会使CAR-T这一技术真正成为一种活的药物，进而能够广泛而方便的供合适的患者使用，并极大地降低成本。
, p: s$ D! M5 F7 V  T1 z% X
4 F* ~* F; k% U8 _! J9 }2 U% U2 W( P1 B$ W$ {9 @
在这一方面，近日有报道指出，Baxalta公司与基因编辑公司Precision BioSciences宣布达成合作，开发基于健康供体T细胞的新型嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)，以用于多种癌症的治疗。根据协议，双方将选择六个肿瘤靶点进行开发合作，并计划在2017年下半年将第一个候选疗法推进临床阶段。Precision BioSciences将主要负责II期临床及之前的研发工作，Baxalta则将主导后期开发和商业化的工作，并支付相应的里程碑款项，涉及金额总计约16亿美元。9 I( a! G2 Z- [8 L
! D2 A, S; M  W1 o0 e

7 x4 y5 e5 p5 e( t+ Q! ~( a2、实体瘤特异性CAR-T* I+ z+ d2 j5 s2 i9 Y! ]% f7 d

& U+ j. x( Q, f5 N" ^; `- s1 D0 [9 F4 ^7 j) G' F
目前的CAR-T技术在血液肿瘤中的B系白血病及淋巴瘤等方面的治疗中展示出惊人的疗效，但是由于实体瘤具有其自身不同于血液肿瘤的诸多特征，如肿瘤微环境的免疫抑制、实体瘤局部的高密度大量的肿瘤细胞压力、实体瘤的高异质性等，这使得针对实体瘤的CAR-T无法展现有效的治疗效果。所以，在针对实体瘤这一肿瘤的主阵地方面，现在的CAR-T还需要做更多工作来进行对实体瘤的治疗，包括实现CAR-T向实体瘤部位的有效趋化、有效应对实体瘤高异质性、安全而有效地突破实体瘤免疫抑制。要同时实现这些方面，需要研发工作者进行更多大胆的尝试和创新，针对实体瘤开发特异性的CAR结构，这一方面笔者目前所涉及的几种全新的CAR结构有信心能够实现这些方面的突破。
0 g" j: \( @+ m  ^6 K  P' s, ~5 @. z" X: u6 e0 ^
( |; H1 G4 ^, o1 O
3、胞外单链抗体人源化改进的进一步优化
6 P' I" r3 I, T% o. R. X4 \4 c# F5 ~7 Z- @5 f. c- Q. r
: H7 X0 J' T& ~
在CAR-T回输进行治疗过程中，还有个问题是不得不面对的问题，就是胞外单链抗体的人源化改进，因为直接使用动物来源的胞外单链抗体，在诸多临床试验中证实会很快由于免疫原性问题导致其被宿主免疫系统清除，进而导致治疗失败。而在对动物来源的胞外单链抗体进行的人源化改进优化工作中，目前的手段虽然能够实现明显降低免疫原性，但是这一方法耗时耗力且由于其中某些序列还是会诱导产生诸如不完全抗体等问题，而导致其对抗原蛋白的亲和力下降，甚至不敏感，而导致迅速复发，并且体内还能够检测到CAR-T的存在，这已经在一些临床试验中被报道。: Q' @) e! \/ q7 c$ p1 i  M1 Z

: L2 B/ d/ ^7 S" _
4 S& z5 S2 p; P所以，如何实现对胞外单链抗体的无免疫原性化改进和优化，将是未来的一个方向和技术突破口。笔者近期所设计的一种基于精准医疗指导下的肿瘤突变相关新抗原筛选及全人源化抗体匹配模型系统，相信能够很好地解决这个问题。
: `+ \2 Y$ T! K( N4 \' e3 J. y/ T3 u5 S- R6 _0 H7 c9 R
: C( q, O0 K; {. k) F
4、简化而安全的突破实体瘤免疫抑制技术6 o' r9 l( w4 W* O7 |7 `3 w# u& k

: a) Y- m9 I& n, |2 R1 R3 {* A: Q' P: ]& }6 s- n
目前，针对实体瘤的肿瘤微环境免疫抑制方面的突破，比较有效的方式是结合抗PD-1/PD-L1抗体或CTLA-4抗体，但这一方式由于这类免疫检查点抗体本身的副作用限制，在提高CAR-T的治疗效果的同时也或多或少地引入了新的副作用。比较好的方式是敲除T细胞本身的PD-1受体等抑制性受体，但是这一途径必须要求配合特异性很好的靶标抗原或者其他自杀开关以确保安全性，而这一受体的敲除相信在CRISPER-Cas9技术的进步下能够很快实现。3 T5 z' G* G1 }

3 v; N+ K* g  Q3 {0 T" m; |% G" V9 Z: l* U/ H
除此之外，还有一种更好地方式，就是采取CAR-T细胞内部同时表达抗PD-1/PD-L1抗体，这样一来就好比给CAR-T穿上为了一层护甲，但是这需要在转染载体和基因结构方面进行进一步优化，以实现抗PD-1/PD-L1抗体的高效表达以达到戒除免疫抑制作用。这方面，上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司拥有该方面专利和技术，已经在激活的T细胞实现抗体的高效表达（称为PIK-T），而目前正在致力于将这一抗体和CAR一同实现高效表达的产业化。
' b, i) j+ c/ U8 f# U0 Q) T+ d% C3 q

8 z, f0 w* b* ]0 M& J0 t5、新的TSA/TAA安全性靶向技术3 \8 B( o" r# t/ H' g
! K$ b/ t; p3 ?( F' @" q7 @
( x( g6 X# i  e3 ^* Y) h
在提高CAR-T的靶向性方面，防止产生脱靶效应方面，要么致力于发现更多可以利用的肿瘤细胞特异性抗原（TSA），而这一方面需要做大量工作，近年来发展的精准医疗相信会对这一方面工作提供有效的促进，笔者最近致力于设计完善的精准医疗指导下的肿瘤突变相关抗原全人源化抗体筛选匹配系统模型，相信会在这方面有较大潜力。除此之外，如能够开发一种特异性的靶向实体瘤TAA的胞外结构，从而实现较多的TAA可以通过这一结构进行安全地靶向，笔者近期正在着手开发的策略和结构相信对这一方面问题的解决有极大潜力。
9 Z2 x, D  p! Y% V( i' R7 J& O: Y/ F; r# Y) Y7 Q

3 J( y& Y# E5 f, H& n7 k6、有效的防复发策略1 i/ ?8 B) B8 E+ [' ^6 I4 R1 M
, }: h( ^# r7 U3 ~2 s2 V3 {
, f: x( ^* q- B( j
由于复发问题是CAR-T不得不面对的一个问题，在清除肿瘤细胞之后，CAR-T也逐渐被清除，这将导致某些表面抗原调低表达、抗原丢失等的肿瘤细胞的得以壮大而导致复发，所以，在TAA特异性较高而不必担心出现后续的脱靶毒性等问题时，如何选择合适的胞内共刺激结构域以及修饰前的细胞亚群，使得部分CAR-T能够以记忆性T细胞形式继续存在，并且CAR为整合型。另外，一个可能的策略将是采用精准免疫细胞（即负载多种肿瘤新抗原的DC激活的新抗原特异性CTL）来修饰成CAR-T，使其具有主抗原靶向激活下的多种抗原系统性杀伤活性，这一方面，上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司正在做相关研究，希望能够有所突破。
- x* U0 O; d/ ~! b8 c; i
8 L9 }0 i! l* _/ k4 h6 e
  W  r4 b! D* Y% Z, z* ]7、简化的制备手段和封闭式细胞制备设备
- u4 {2 D# R7 V: Z: p! c
+ |' S9 Y6 x* b% N. t+ E8 p% c
在uCAR-T基础上，结合双特异性抗体等策略，CAR-T在安全有效的前提下作为药物使用的可能性正在逐渐变为现实，今后，CAR-T制备产业化方面，需要开发更为简化的短时间培养方法和技术，并为了降低人工操作带来的细胞产品质量差异及提高产品质量，需要进一步开发一体式连续封闭培养设备，将T细胞分选、培养、基因修饰整合到一起，在同一台仪器内实现，并有效保持产品的质量和一致性。
" |) O8 N1 E( {* T- {; O, {+ D" z: m7 e  L' t) D9 g. y  Z- x

* e6 O& f, c; S: ~& c  f综上而言，CAR-T技术的研发和产业化发展，在今后几年之内，借力于基因编辑技术和精准医疗事业的进步而将迎来快速发展，让我们拭目以待。

qq2081

你是作者本人吧