腺病毒的包装，纯化和感染

名山大川

腺病毒的包装，纯化和感染" g* O! R; E( q, a5 S. p# L) c7 r( {
技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，
' k* F- V, p3 H: j/ v6 l并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。
, \0 t7 ]7 `* i5 j- D利用带有 E1 基因的 293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并
7 g5 e- n8 `8 n8 B通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎1006 k% {9 @8 P. |8 e. i4 p
％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不
1 X' b: ~* o+ r5 p6 Q" G可避免的细胞毒性问题。
' j4 V. O! D1 S" a' _& R7 r2 f, Z所需试剂：
. l" S' O7 j2 @& N$ s6 r# J; h? 293细胞；# S# K) B, C8 C
? 重组好的腺病毒质粒；: n0 m  E% q6 {4 d
? Pac I限制性内切酶；
3 [" f" N5 e# N  h& ~. z- o? 质粒回收相关试剂；% E" l0 B4 L- Z4 C3 w: }
? 细胞培养、转染相关试剂；' p: D, n5 r" M% E2 H
? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;  |+ l/ S2 D: Y* h! R! F. Y. e; W
? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；+ @* D% [6 Q" C4 X- ?7 y3 ]( w
? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；
, f+ f  }# h. H* A? Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；* C& J& I: ~4 o
? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；# }  w# g7 F& X, I7 E; f- z. c5 `
? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），
# u3 [) o7 z2 g! S# X1 aMW=8000~14400；6 L: g) j$ n6 U8 @9 B2 g
? 灭菌甘油。
) E$ S% p; F# u3 ^+ G操作流程：
( g* O. e  w2 G/ J1. 293细胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells 在转染前24小时接种
& H1 y1 Q  F, r& r于1或2个60mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；! f: m' H0 ~. d+ h, q% u
2. 在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm 细胞盘需要6μgDNA）。
/ T! _4 N  U- {( K8 y3 b( e处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl 无菌水中；
' t  K# B9 Q+ s4 m2 b3. 用PEI或其他转染试剂将6μgPac I处理过的质粒转染细胞；2 r! H0 c& G) t  K
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' n% y* x, Y( e2 M6 @
4 k; D/ d  O, S4. 8 个小时后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%
) p0 ], J7 Z! kPen/Strep）；5 V9 |% B1 m9 j( R5 E
5. 在转染后 7 到 10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入 50ml  L3 g- ^, u% v1 u/ k- L
锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，! x6 B3 D  V3 F1 ]" `/ o
37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，7 B$ N7 _0 N, m4 d1 V
可保存于-20℃；5 ~8 z7 C: O$ t" Z3 A. W3 u
6. 将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm 培养盘中，以30-50%的体积比加
/ W" g8 V& e# h8 W7 ~入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；
1 A" L) H* b* C& @  z7. 在有 1/3 到 1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可进一! h& \# T- t) a- Z" ?( x8 G
步通过Westernblot 或PCR（5μl 病毒上清加上10μl PCR-gradeProteaseK，
  c7 P5 O) q! o) l9 Z" Y& l# W55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl 进行PCR反应）证( A6 ?; ~; h7 k% R& q! v& Q2 }
实重组腺病毒的存在；& K  a( Q: s, E$ Z9 G" f
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' G2 N9 F0 G7 G2 v9 Z8. 按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10 infectious
( V( `  j: L' c7 H# A) r8 Mparticles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；. V% J; P6 y* y( t7 H, q" X" i
9. 为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细; H2 t% z) e$ v9 {. O
胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm 细胞培养盘中的293
; D! ?/ X' V: g- g- d/ ^细胞，以获得足够量的病毒；
) l9 z% D$ q  [, ?10. 将15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；
4 U  o4 w7 `% q2 v" f6 a& r11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；. s( z- \$ k: g( [1 M
12. 超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
+ M, o( _0 D' Y# [: j4 e7 n: V7 u13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具* ^4 D0 v) w; G
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用
4 F( I; Y% R" D* g! J16号针头将这一条带收集；
  z- b# [! i; q7 H- a14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小
$ m+ H( n4 ]# H' B时；  X. I% A. Q8 m+ b3 s, G1 ?
15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；
8 Q  j( {7 s' |5 _, c16. 在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当
3 [# `, Q9 I, ^/ r  s' V8 L" y于4×109病毒颗粒；+ b) J, T) p2 B0 P
17. 长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；; ^. }* U% }( B6 }  H5 Y; L
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18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒$ p6 ~4 E* m' f4 \" |! {$ L
副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，
8 V0 Q6 W% l  d" l' H. ]10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：  v7 \: Z; Q* }/ H9 g" }8 `
1000的Polybrene。在 37度下平板离心30分钟；& r; g) f6 f! H. M& B
19. 感染 8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸( D5 }" j- }" _+ ~1 l5 x
中，加入适量全培液。